[發明專利]一種特異性分離富集內源性磷酸化肽的方法

在審

• 申請號: 201910287501.5
• 申請日: 2019-04-11
• 公開（公告）號: CN110156869A
• 公開（公告）日: 2019-08-23
• 發明（設計）人: 鄧春暉;李沂霖
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C07K1/22
• 分類號: C07K1/22;B01J20/06;B01J20/28;B01J20/30
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 張磊

1.一種特異性分離富集內源性磷酸化肽的方法，其特征在于具體步驟如下：

磁性介孔雙金屬氧化物材料與上樣緩沖溶液混合，配置成材料分散液，取10-20μL該材料分散液和目標磷酸化肽段溶液加入到上樣緩沖溶液中，在37℃下孵育30-60分鐘，用上樣緩沖溶液洗滌，用 0.4 M氨水作為洗脫緩沖液，將洗脫液點靶，進行質譜分析；

其中，磁性介孔雙金屬氧化物材料與上樣緩沖溶液的質量體積比為：10g：1L；

上樣緩沖溶液為含有體積比30%-60%乙腈和體積比0.1%三氟乙酸的緩沖溶液；

目標磷酸化肽段溶液為β-酪蛋白酶解液，材料分散液與目標磷酸化肽溶液體積比為：20：1-10000:1。

2.根據權利要求1所述的一種特異性分離富集內源性磷酸化肽的方法，其特征在于，磁性介孔雙金屬氧化物材料的合成步驟如下：

（1）將六水合三氯化鐵溶解于乙二醇中，至溶液澄清透明后加入無水醋酸鈉，經充分攪拌超聲后轉移至反應釜中，在100-450℃下加熱10-20小時，反應完畢后待反應釜冷卻至室溫，用去離子水和無水乙醇充分洗滌所得產物，于40-75℃下真空干燥；

（2）將步驟（1）所得產物均勻分散于溶劑中，加入二氧化鋯和二氧化鈦前驅體，將所得混合溶液在室溫下攪拌反應8-24小時，反應結束后用無水乙醇充分洗滌，所得產物，于40-75℃下真空干燥，接著將產物在500℃下煅燒1-2小時；

（3）將步驟（2）所得產物均勻分散于含有十六烷基三甲基溴化銨的溶劑中，超聲分散，然后加入堿，滴加正硅酸四乙酯和乙醇混合溶液，在60℃下加熱攪拌12小時，反應完畢冷卻至室溫，用水和無水乙醇充分洗滌所得產物，于40-75℃下真空干燥；

（4）將步驟（3）所得產物在空氣中300-500℃下煅燒1-5小時；即得所需產品。

3.根據權利要求2所述的一種特異性分離富集內源性磷酸化肽的方法，其特征在于步驟（2）中所述的溶劑為乙醇或乙醇/水混合溶液。

4.根據權利要求2所述的一種特異性分離富集內源性磷酸化肽的方法，其特征在于步驟（3）中所述的堿為氫氧化鈉、碳酸鈉或氨水中的一種或幾種。

5.根據權利要求2所述的一種特異性分離富集內源性磷酸化肽的方法，其特征在于步驟（2）中所述二氧化鈦前驅體為鈦酸四異丙酯、鈦酸正丁酯或鈦酸四乙酯中的一種或幾種，二氧化鋯的前驅體為異丙醇鋯。

6.根據權利要求2所述的一種特異性分離富集內源性磷酸化肽的方法，其特征在于步驟（2）中步驟（1）所得產物與二氧化鈦和二氧化鋯前驅體質量之和的質量比為1:3-1:5。

7.根據權利要求2所述的一種特異性分離富集內源性磷酸化肽的方法，其特征在于步驟（3）中溶劑為去離子水或乙醇/水混合溶液。