[發(fā)明專利]檢測(cè)血液中維生素K1含量的液質(zhì)分析方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910287337.8
• 申請(qǐng)日: 2019-04-11
• 公開（公告）號(hào): CN109959740A
• 公開（公告）日: 2019-07-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉春冉;佟洪梅;賈永娟;倪君君
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京和合醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)股份有限公司
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02;G01N30/72;G01N30/04;G01N30/06;G01N30/88
• 代理公司: 北京雙收知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11241
• 代理人: 解政文

1.一種檢測(cè)血液中維生素K1含量的液質(zhì)分析方法，其特征在于：它包括以下步驟：

(一)、標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)定

(a)、標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：

精確稱維生素K1標(biāo)準(zhǔn)品15.46mg置于10mL容量瓶中，用10mL純甲醇溶解并定容至刻度，得到標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液A，將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液A用含水量為5％-15％的甲醇溶液進(jìn)行稀釋，分別在含有0.5-5000ng/mL維生素K1的濃度范圍內(nèi)配制出各濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，并在-80℃條件下保存；

(b)、標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)液的配制：

精確稱取維生素K1同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品1.00mg于1mL容量瓶中，用1mL純甲醇溶解并定容至刻度，得到內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液B，將內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液B用含水量為5％-15％的甲醇溶液進(jìn)行稀釋，得到含有維生素K1同位素的濃度為10ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)液，并在-80℃條件下保存；

(c)、用標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)定，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

用移液槍分別移取至少三種不同濃度的10μL標(biāo)準(zhǔn)工作液，將上述至少三種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液分別與10μL的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)液和80μL替代基質(zhì)混合，上述替代基質(zhì)為含有4％的牛血清白蛋白，并置于2.0mL離心管中制成至少三種標(biāo)準(zhǔn)溶液，上述標(biāo)準(zhǔn)溶液分別在轉(zhuǎn)速為1000-2000rpm下渦旋混勻30s-1min后，向上述離心管中加入200-400μL的甲醇，并在轉(zhuǎn)速為1000-2000rpm下渦旋混勻3-5min，再向上述離心管中加入400-800μL的正己烷，并在轉(zhuǎn)速為1000-2000rpm下渦旋混勻5-10min，然后在轉(zhuǎn)速為12000-14000rpm下離心5-10min，得到上清液，分別移取400-550μL上述上清液置于另一個(gè)離心管中，在常溫下用氮?dú)獯?0min-20min直至上述上清液全部被吹干后，向吹干的離心管中分別加入100μL復(fù)溶液，該復(fù)溶液是含有0.05％-2％的甲酸和含有5％-15％水的甲醇溶液，在轉(zhuǎn)速為1000-2000rpm下渦旋混勻30s-1min后，再在轉(zhuǎn)速為12000-14000rpm下離心5-10min得上清液，分別取上述上清液100μL，用高效液相色譜三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀對(duì)上述上清液進(jìn)行檢測(cè)，分別得出上述至少三種標(biāo)準(zhǔn)溶液中的維生素K1色譜圖和對(duì)應(yīng)的維生素K1同位素色譜圖，以上述至少三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的維生素K1峰面積與對(duì)應(yīng)的維生素K1同位素峰面積之比作為標(biāo)準(zhǔn)曲線圖的縱坐標(biāo)y，以上述標(biāo)準(zhǔn)工作液中含有維生素K1的濃度與標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)液中含有維生素K1同位素濃度之比作為標(biāo)準(zhǔn)曲線圖的橫坐標(biāo)x，將以上檢測(cè)所得至少三組數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸，擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝a*x+b，并且得出權(quán)重系數(shù)a和b；

(二)、檢測(cè)血液的離心

取待檢測(cè)血液至少5mL，在離心速度為3500rpm下離心10min，得到上清液即血清，將上述血清置于-80℃冷凍下保存至分析前備用；

(三)、待測(cè)樣品處理

(d)、用移液槍移取步驟(c)的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)液10μL于1.5mL的離心管中，然后加入步驟(二)的100uL的血清于上述離心管中，在轉(zhuǎn)速為1000-2000rpm下渦旋混勻30s-1min，然后向上述離心管中加入200-400μL甲醇，并在轉(zhuǎn)速為1000-2000rpm下渦旋混勻3-5min后，再向上述離心管中加入400-800μL正己烷，在轉(zhuǎn)速為1000-2000rpm下渦旋混勻5-10min后，再在轉(zhuǎn)速為12000-14000rpm下離心5-10min，得到上清液，分別移取400-550μL上述上清液置于另一個(gè)離心管中，在常溫下用氮?dú)獯?0min-20min直至上述上清液全部被吹干后，向吹干的離心管中加入100μL復(fù)溶液，該復(fù)溶液是含有0.05％-2％的甲酸和含有5％-15％水的甲醇溶液，在轉(zhuǎn)速為1000-2000rpm下渦旋混勻30s-1min后，再在轉(zhuǎn)速為12000-14000rpm下離心5-10min，得到的液體即為待測(cè)樣品；

(四)、待測(cè)樣品的檢測(cè)

移取步驟(d)待測(cè)樣品100μL，使用高效液相色譜三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀對(duì)上述待測(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)，得出上述待測(cè)樣品的維生素K1色譜圖和維生素K1同位素色譜圖，將上述色譜圖中的維生素K1峰面積和維生素K1同位素峰面積之比y代入上述步驟(c)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y＝a*x+b中，通過計(jì)算得到待檢測(cè)樣品中維生素K1濃度與標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)液中維生素K1同位素濃度之比x，標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)液中維生素K1同位素的濃度是已知的，通過計(jì)算得到待檢測(cè)血液中的維生素K1濃度。