[發明專利]一種包涵體蛋白的純化方法及其應用

在審

• 申請號: 201910287003.0
• 申請日: 2019-04-11
• 公開（公告）號: CN110004132A
• 公開（公告）日: 2019-07-12
• 發明（設計）人: 王會征;蘭玉彬;韓鑫
• 申請（專利權）人: 山東理工大學
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/70
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明屬于生物技術領域，提供一種包涵體蛋白的純化方法及其應用。純化方法主要是全程使用一種經實驗確定的溶解包涵體的緩沖液（10mM Tris?HCl pH10.3，150mM NaCl，2M尿素，10mM咪唑，5mMβ?巰基乙醇）及相關洗雜液、洗脫液，純化完成后通過透析的方法將尿素、咪唑最終去除，對獲得的純蛋白進行體外酶活性測定、體內接種致病性測定等，顯示所獲純蛋白Pl101具較高酶活性及致病性。本發明方法快速、簡便、有效地獲得具生物學活性的目標蛋白，降低了純化成本。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，提供一種包涵體蛋白的純化方法及其應用。具體地說，本發明涉及一種源于辣椒疫霉菌的果膠裂解酶Pl101原核表達形成的包涵體蛋白質快速、簡便純化方法，且所獲純蛋白Pl101具較高酶活性及致病性。

背景技術

外源基因在原核細胞中表達時，尤其是在大腸桿菌中高效表達時，易形成由膜包裹的高密度、不溶性蛋白質顆粒，即包涵體。包涵體的形成是比較復雜的，主要是因為在重組蛋白的表達過程中缺乏某些蛋白質折疊的輔助因子或環境不適，無法形成正確的次級鍵等。功能性的蛋白質總是折疊成特定的三維結構型，而包涵體內的蛋白是非結晶、無定形的非折疊狀態的聚集體，不具有生物學活性。

包涵體的形成對重組蛋白的純化及酶活測定等下游生化實驗的進行帶來了很大的障礙，常規實驗方法是將包涵體徹底溶解，通過6-8M鹽酸胍或8-10M尿素等變性劑變復性的手段獲得可溶性蛋白，而上述方法一個不容忽視的問題是蛋白質的收率較低或易造成蛋白的失活等，且純化成本較高。一種快速、簡便且有效純化包涵體蛋白的方法對開展蛋白質組學、酶學、遺傳學等相關實驗可提供有力的技術支持。

果膠裂解酶（Pectate lyase，Pl）為辣椒疫霉菌（Photophthora capsici）等植物病原菌的重要細胞壁降解酶，屬植物病原菌的關鍵致病因子，通過降解寄主細胞壁來增強病原菌對寄主的親和力，從而引起致病。Pl能夠降解植物細胞壁中的果膠，對病原菌侵染寄主植物具重要作用。研究發現，Pl對甲酯化的果膠分子親和力較高，通過β-消除的方式裂解甲酯基的α-1，4糖苷鍵，生成在非還原末端的C4和C5位置有不飽和雙鍵的半乳糖醛酸。對果膠裂解酶Pl的功能研究已成為分子植物病理學的熱點科學問題。

不同植物病原菌的Pl特性（分子量、最適pH值、最適溫度、底物特異性、動力學參數、所需金屬離子及濃度等）存在顯著差異，而源于同一病原菌的Pl基因成員調控病菌與寄主互作特性及致病性也存在明顯分化。原因在于Pl基因家族及個體成員較多，且家族間氨基酸序列同源性相似度較低（<30%），由此導致不同Pl功能特性差異較大。

對Pl開展相關功能特性及致病機制研究的一個前提是獲得目標基因及其純蛋白，本發明即是在前期研究基礎上，對克隆自辣椒疫霉菌的一個Pl基因Pl101進行了原核表達，并對表達出的包涵體蛋白進行了純化步驟的探索，確定了一種快速、簡便、有效地獲得目標蛋白Pl101的方法，并對純蛋白Pl101進行了酶活性及致病性測定等，證明通過本方法獲得的純蛋白具較高酶活性及致病性，為相關蛋白開展酶學、遺傳學、蛋白質組學等研究提供了技術支持與借鑒。

發明內容

本發明的目的在于，提供一種包涵體蛋白的純化方法及其應用，以解決相關技術問題。該方法可快速、簡便、有效地純化包涵體蛋白且通過該方法所獲純蛋白具較高酶活性及致病性，解決了包涵體蛋白難純化或純化得率低、純化后蛋白無活性或活性低的技術問題。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：一種包涵體蛋白Pl101的純化方法及其應用，包涵體蛋白Pl101的純化方法包括有下列步驟：

A：將靶基因Pl101構建原核表達體系（表達載體pET-28a），轉化大腸桿菌（表達菌株E.coli BL21 (DE3) pLysS）誘導表達出融合蛋白Pl101，確定的包涵體蛋白誘導表達條件為：誘導溫度16℃，誘導劑IPTG終濃度為1mM/L，誘導時間16h；