[發(fā)明專利]一種包涵體蛋白的純化方法及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910287003.0
• 申請(qǐng)日: 2019-04-11
• 公開（公告）號(hào): CN110004132A
• 公開（公告）日: 2019-07-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王會(huì)征;蘭玉彬;韓鑫
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東理工大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/88
• 分類號(hào): C12N9/88;C12N15/70
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1.一種包涵體蛋白Pl101的純化方法及其應(yīng)用，其特征在于，包涵體蛋白Pl101的純化方法包括有下列步驟：

A：將靶基因Pl101構(gòu)建原核表達(dá)體系（表達(dá)載體pET-28a），轉(zhuǎn)化大腸桿菌（表達(dá)菌株E.coli BL21 (DE3) pLysS）誘導(dǎo)表達(dá)出融合蛋白Pl101，確定的包涵體蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件為：誘導(dǎo)溫度16℃，誘導(dǎo)劑IPTG終濃度為1mM/L，誘導(dǎo)時(shí)間16h；

B：實(shí)驗(yàn)表明表達(dá)出的融合蛋白Pl101在常規(guī)緩沖液（10mM Tris-HCl pH7.0，150mMNaCl）中不可溶，即上述方法表達(dá)出的融合蛋白Pl101為包涵體，經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定可將包涵體溶解的緩沖液A為10mM Tris-HCl pH10.3，150mM NaCl，2M尿素，10mM咪唑，5mM β-巰基乙醇；

C：對(duì)在緩沖液A中溶解的融合蛋白Pl101進(jìn)行親和層析純化，親和層析介質(zhì)為Ni-NTA瓊脂糖凝膠，并對(duì)洗雜液、洗脫液進(jìn)行不同條件的優(yōu)化，經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定的三種洗雜液分別為緩沖液B（10mM Tris-HCl pH10.3，150mM NaCl，2M尿素，20mM咪唑，5mM β-巰基乙醇）、C（10mMTris-HCl pH10.3，150mM NaCl, 2M尿素，20mM咪唑，5mM β-巰基乙醇、0.5%(v/v)吐溫-20）、D（10mM Tris-HCl pH10.3，150mM NaCl，2M尿素，20mM咪唑，5mM β-巰基乙醇、0.5%(v/v)乙醇），洗脫液為緩沖液E（10mM Tris-HCl pH10.3，150mM NaCl，2M尿素，100mM咪唑，5mM β-巰基乙醇），即緩沖液A組份純化全程使用以防蛋白沉淀，經(jīng)透析袋4℃低溫透析的方法將最終緩沖液替換為10mM Tris-HCl pH10.3，150mM NaCl，5mM β-巰基乙醇，將尿素、咪唑完全去除，獲得純蛋白Pl101，純蛋白經(jīng)Western blotting雜交驗(yàn)證。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種包涵體蛋白Pl101的純化方法及其應(yīng)用，其特征在于：所述純蛋白Pl101采用底物聚半乳糖醛酸反應(yīng)法測定的酶活性為750U/mg。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種包涵體蛋白Pl101的純化方法及其應(yīng)用，其特征在于：所述純蛋白Pl101采用寄主植物辣椒健康葉片接種法測定其具有較高致病活性。