[發明專利]用于膀胱癌診斷的尿液微小RNA靶基因數據庫比值模型建立方法

在審

• 申請號: 201910283065.4
• 申請日: 2019-04-10
• 公開（公告）號: CN109880909A
• 公開（公告）日: 2019-06-14
• 發明（設計）人: 董輝;李明明
• 申請（專利權）人: 寧夏醫科大學總醫院
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6851
• 代理公司: 寧夏合天律師事務所 64103
• 代理人: 郭立寧

1.一種用于膀胱癌診斷的尿液微小RNA靶基因數據庫比值模型建立方法，其特征在于：該比值模型的建立方法步驟如下：

（1）模型數據信息采集：采集has-miR-182-5p和has-miR-152-3p在miRBase數據庫相關信息；

（2）尿液標本收集及保存：樣本的收集采用15ml無菌無酶離心管，收集晨尿新鮮尿液7ml，其中加入3.54g異硫氰酸胍（sigma），待溶解完全后加入HEPES鹽溶液（Thermo）調節尿液樣本的PH值至7，最終定容至總體積10ml，此時HEPES濃度為0.5 mol/l，異硫氰酸胍濃度為3mol/l，樣本統一在-80℃條件下保存；

（3）樣品中總RNA的制備：

a.將收集的尿液樣本解凍，充分混運，室溫下裂解5分鐘；

b.加入5ml氯仿，劇烈震蕩，室溫靜止后溶液形成分層后，4℃條件下12000rpm離心15分鐘，離心后混合液體分層為下層酚氯仿相，中層蛋白層，上層無色水相，RNA全部被分配與水相中；

c.量取轉移液的體積，緩慢加入轉移液體積1/3體積的無水乙醇（如：300 μl的轉移液加100 μl無水乙醇），混勻（此時可能會出現沉淀），將得到的溶液和沉淀一起轉入吸附柱miRspin，室溫放置2 min, 室溫 12,000 rpm離心30 sec，離心后棄掉吸附柱miRspin，保留流出液；

d.量取流出液的體積，緩慢加入流出液體積2/3體積的無水乙醇混勻。將得到的溶液和沉淀一起轉入吸附柱miRelute，室溫放置2 min，室溫 12,000 rpm 離心30 sec，離心后棄掉流出液，保留吸附柱miRelute；

e.向吸附柱miRelute中加入500 μl去蛋白液MRD，室溫靜置2 min，室溫 12,000 rpm離心30 sec，棄廢液；

f.向吸附柱miRelute中加入500 μl漂洗液RW，室溫靜置2 min，室溫 12,000 rpm離心30 sec，棄廢液；

g.重復操作步驟6；

h.將吸附柱miRelute放入2 ml收集管中，室溫 12,000 rpm 離心1 min，去除殘余液體；

r.將吸附柱miRelute轉入一個新的RNase-Free 1.5 ml離心管中，加20μl RNase-FreeddH₂O，室溫放置2 min，室溫 12,000 rpm 離心2 min，獲得總miRNA，miRNA溶液保存于-80℃冰箱。

（4）第一鏈cDNA序列的合成：

取PCR管配置反轉錄體系，反轉錄體系為：2×miRNA RT Reaction Buffer 10μl:，miRNA RT Enzyme Mix 2μl，上步提取的總miRNA溶液8 μl ，總體積20μl。反應條件為：42℃60min，95℃ 3min。使用Analytik Jena PCR擴增儀PowerCycler進行反轉錄，cDNA置于-20℃儲存備用；

（5）熒光定量PCR檢測：

使用反轉錄得到的cDNA樣品進行檢測。反應體系為：2×miRcute Plus miRNA PreMix:10 μl，Reverse Primer 0.4 μl，Forward Primer 0.4 μl，miRNA第一鏈 cDNA 2 μl，ddH2O補足至20μl，實時PCR反應條件：95℃ 15min；94℃20sec，63℃ 30sec，72℃34sec，5個循環；94℃ 20sec，60℃34sec，40個循環。每個孔設3次重復，取平均值進行計算，每對引物設置陰性質控，采用ddH₂O作為陰性模板對照，擴增反應在實時熒光定量 PCR 儀 LightCyler480上進行；

（6）計算方式：

miRNA檢測結果Ct的比值（Ct _182-5p/Ct _152-3p）作為診斷指標。