[發明專利]一種豬腹膜間皮細胞的培養方法

有效

• 申請號: 201910282885.1
• 申請日: 2019-04-09
• 公開（公告）號: CN109810939B
• 公開（公告）日: 2023-05-09
• 發明（設計）人: 劉宇;邱銀生;趙文華;徐健峰
• 申請（專利權）人: 武漢輕工大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 深圳市世紀恒程知識產權代理事務所 44287
• 代理人: 胡海國

1.一種豬腹膜間皮細胞的培養方法，其特征在于，包括以下步驟：

將清理后的腹膜平鋪于培養皿中進行酶解消化，得原代細胞懸液；

將所述原代細胞懸液離心，保留沉淀物，并將所述沉淀物用原代培養液重懸，篩選得原代細胞；

待所述原代細胞密度達到80％～90％時，使用傳代培養液對所述原代細胞進行傳代，得傳代細胞；

其中，所述原代培養液包含DMEM/F-12基礎培養基、15％～20％(v/v)胎牛血清、0.8％～1.1％(v/v)青鏈霉素混合液、0.03～0.05％(v/v)EGF以及0.05％～0.12％(v/v)ITS；

所述傳代培養液包含DMEM/F-12基礎培養基、10％～15％(v/v)胎牛血清、0.8％～1.1％(v/v)青鏈霉素混合液、0.03～0.05％(v/v)EGF以及0.05％～0.12％(v/v)ITS。

2.如權利要求1所述的豬腹膜間皮細胞的培養方法，其特征在于，將清理后的腹膜平鋪于培養皿中進行酶解消化，得原代細胞懸液的步驟之前，還包括：

取豬的腹膜，清除掉所述腹膜表面殘余的脂肪，于無菌環境下，用PBS反復沖洗所述腹膜的正反面，得清理后的腹膜。

3.如權利要求1所述的豬腹膜間皮細胞的培養方法，其特征在于，將清理后的腹膜平鋪于培養皿中進行酶解消化，得原代細胞懸液的步驟包括：

將清理后的腹膜平鋪于培養皿中，加入胰酶-EDTA細胞消化液使所述腹膜被完全浸沒，于恒溫培養震蕩器中消化20～30min，得消化液；

向所述消化液中加入胎牛血清終止消化，棄去所述腹膜，得原代細胞懸液；

其中，所述胎牛血清的加入量為所述胰酶-EDTA細胞消化液的加入量的15％～20％(v/v)。

4.如權利要求1所述的豬腹膜間皮細胞的培養方法，其特征在于，將所述原代細胞懸液離心，保留沉淀物，并將所述沉淀物用原代培養液重懸，篩選得原代細胞的步驟包括：

將所述原代細胞懸液以1500～2000rpm轉速離心10～15min，棄去上清液，保留沉淀；

將所述沉淀用原代培養液重懸，移入細胞培養瓶中，于CO2培養箱中培養，得原代細胞。

5.如權利要求4所述的豬腹膜間皮細胞的培養方法，其特征在于，將所述沉淀用原代培養液重懸，移入細胞培養瓶中，于CO₂培養箱中培養，得原代細胞的步驟中，所述于CO₂培養箱中培養時，開始培養后的第30～36h首次更換所述原代培養液，之后，每隔22～24h更換一次所述原代培養液。

6.如權利要求1所述的豬腹膜間皮細胞的培養方法，其特征在于，待所述原代細胞密度達到80％～90％時，使用傳代培養液對所述原代細胞進行傳代，得傳代細胞的步驟包括：

待所述原代細胞密度達到80％～90％時，用PBS潤洗所述原代細胞，然后加入胰酶-EDTA細胞消化液，于CO₂培養箱中消化2～6min后，加入傳代培養液終止消化，得混合懸液；

吹打所述混合懸液至細胞懸浮后，以800～1500rpm轉速離心6～10min，棄去上清液，加入所述傳代培養液重懸浮，然后分瓶培養，得傳代細胞。

7.如權利要求6所述的豬腹膜間皮細胞的培養方法，其特征在于，待所述原代細胞密度達到80％～90％時，用PBS潤洗所述原代細胞，然后加入胰酶-EDTA細胞消化液，于CO₂培養箱中消化2～6min后，加入傳代培養液終止消化，得混合懸液的步驟中，

所述傳代培養液的加入量與所述胰酶-EDTA細胞消化液的加入量相等。