[發(fā)明專利]一種快速無標(biāo)簽表面增強(qiáng)拉曼散射檢測金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的方法

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• 申請日: 2019-04-10
• 公開（公告）號: CN109813701A
• 公開（公告）日: 2019-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 顧兵;汪崇文;徐玲;馬萍;王蕾
• 申請（專利權(quán)）人: 徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院
• 主分類號: G01N21/65
• 分類號: G01N21/65;G01N1/28
• 代理公司: 北京文苑專利代理有限公司 11516
• 代理人: 何新平

本發(fā)明公開了一種快速無標(biāo)簽表面增強(qiáng)拉曼散射檢測金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的方法。本發(fā)明中適配體用于結(jié)合目標(biāo)菌并且作為模板，介導(dǎo)納米銀粒子的原位合成。包覆聚乙烯亞胺的Fe₃O₄磁性納米顆粒通過靜電吸引用于細(xì)菌的有效捕獲和富集，特定的SERS譜隨著Fe₃O₄@PEI?細(xì)菌?銀納米粒子復(fù)合物的形成而增強(qiáng)，從而達(dá)到特定的目標(biāo)細(xì)菌無標(biāo)記檢測。本發(fā)明聚乙烯亞胺的Fe₃O₄磁性納米?？梢钥焖購娜芤褐胁东@和分離細(xì)菌，捕獲效率高。檢測靈敏度可達(dá)10²cfu/mL，檢測時間小于30分鐘。該方法特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、操作簡便、成本低，可用于不同的病原菌鑒別，對血液樣品同樣有效。該方法是用于臨床和食品安全中的病原菌檢測一種很有前途的工具。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)菌檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速無標(biāo)簽表面增強(qiáng)拉曼散射檢測細(xì)菌的方法。

背景技術(shù)

與細(xì)菌相關(guān)的疾病，如霍亂、敗血癥和感染性腹瀉，一直是主要的公共衛(wèi)生威脅，造成高死亡率和高經(jīng)濟(jì)損失。世界衛(wèi)生組織聲明每年有超過170萬人死于這些細(xì)菌疾病?？股貙Υ蠖鄶?shù)致病菌仍然有效，但是近年來，一些耐藥菌出現(xiàn)并傳播，從而導(dǎo)致情況惡化。用于細(xì)菌的早期檢測從而指導(dǎo)合理使用抗生素的檢測技術(shù)應(yīng)被開發(fā)。

目前有許多方法用于細(xì)菌的定性和定量檢測，如平板培養(yǎng)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、測序及質(zhì)譜。然而，這些方法也有缺點(diǎn)。例如,平板培養(yǎng)，復(fù)雜、耗時，并且很容易出現(xiàn)手工錯誤；PCR，在核酸擴(kuò)增過程中容易出現(xiàn)假陰性或陽性；ELISA，需要多步化學(xué)試劑和免疫反應(yīng)；DNA測序和質(zhì)譜分析可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的微生物學(xué)鑒定，但過程繁瑣，設(shè)備昂貴，需要操作人員技術(shù)精湛，從而限制了在現(xiàn)場檢測中的應(yīng)用。

近年來，表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)通過“整個有機(jī)體指紋”進(jìn)行細(xì)菌鑒定已成為一種新的研究方向?；诒砻嬖鰪?qiáng)拉曼散射的細(xì)菌分析方法的優(yōu)點(diǎn)是:無需培養(yǎng)，靈敏度高，快速檢測，無損數(shù)據(jù)采集，操作方便，指紋識別檢測(無標(biāo)簽)。SERS通過可以二次增強(qiáng)表面電磁場的金銀作為表面活性基底材料來增強(qiáng)了細(xì)菌固有的振動指紋。目前有三種方法：(1)膠體金或者膠體銀活性納米材料與細(xì)菌混合；(2)對SERS底物進(jìn)行修飾以捕獲細(xì)菌；(3)在細(xì)菌上直接合成銀納米粒子。這些方法都可以得到典型的SERS譜細(xì)菌。然而，在復(fù)雜的臨床樣本中，無標(biāo)記SERS檢測比較容易受到干擾。需要繁瑣的樣品預(yù)處理來減少來自其它組分復(fù)雜的光譜干擾。此外,細(xì)菌無標(biāo)記SERS檢測方法通常缺乏選擇性和特異性，很難應(yīng)用到含有多種細(xì)菌的樣品中。

核酸適配體是通過核酸的系統(tǒng)指數(shù)富集進(jìn)化而得到的配體(SELEX)，是單鏈DNA或RNA能夠與靶結(jié)合的分子，具有較高的特異性和親和力。適配體可以通過化學(xué)方法合成，而且比抗體更加穩(wěn)定，因此，它們是低成本的。許多細(xì)菌寡核苷酸適配子,包括大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌，單核增生李斯特菌和沙門氏菌已被識別并作為生物識別分子用于特定病原體的檢測。目前有報道基于核酸適配體原位還原納米銀的方法，用于無標(biāo)記SERS的檢測特異性病原體，適配體和細(xì)菌的特異性識別獲得了特定細(xì)菌的高質(zhì)量SERS光譜。但是這種方法應(yīng)用于復(fù)雜樣品仍然存在需要多級樣品預(yù)處理和離心分離的問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在解決上述問題，本發(fā)明提出了一種靈敏、特異的SERS的技術(shù)，一種快速、無標(biāo)簽的適配體識別與磁分離相結(jié)合的細(xì)菌檢測方法。

本發(fā)明中適配體用于結(jié)合目標(biāo)菌并且作為模板，介導(dǎo)納米銀粒子的原位合成。包覆聚乙烯亞胺(PEI)的Fe₃O₄磁性納米顆粒(Fe₃O₄@PEI MNPs)通過靜電吸引用于細(xì)菌的有效捕獲和富集，特定的SERS譜隨著Fe₃O₄@PEI-細(xì)菌-銀納米粒子復(fù)合物的形成而增強(qiáng)，從而達(dá)到特定的目標(biāo)細(xì)菌無標(biāo)記檢測。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：