[發明專利]一種快速無標簽表面增強拉曼散射檢測金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的方法

在審

• 申請號: 201910282679.0
• 申請日: 2019-04-10
• 公開（公告）號: CN109813701A
• 公開（公告）日: 2019-05-28
• 發明（設計）人: 顧兵;汪崇文;徐玲;馬萍;王蕾
• 申請（專利權）人: 徐州醫科大學附屬醫院
• 主分類號: G01N21/65
• 分類號: G01N21/65;G01N1/28
• 代理公司: 北京文苑專利代理有限公司 11516
• 代理人: 何新平

1.一種快速無標簽表面增強拉曼散射檢測金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的方法,其特征在于，按照如下步驟進行：

1)將細菌特異性核酸適配體添加到測試細菌的樣品中孵育,使核酸適配體分子特異性地與目標細菌表面結合；

2)將聚乙烯亞胺的Fe₃O₄磁性納米粒添加到細菌樣品中，利用帶正電荷的聚乙烯亞胺殼層和帶負電荷細菌-適配體復合物的相互吸引作用，捕獲細菌-適配體復合物；

3)用外部磁鐵分離出聚乙烯亞胺的Fe₃O₄-細菌-適配體納米粒子復合物，使其吸附銀離子并加入NaBH₄，將銀離子還原成銀納米粒子并沉積在細菌的表面，從而形成聚乙烯亞胺的Fe₃O₄-細菌-適配體-銀納米粒子復合物；

4)將聚乙烯亞胺的Fe₃O₄-細菌-適配體-銀納米粒子復合物干燥后進行SERS檢測，獲得與適配體結合的細菌的SERS光譜，從而達到特定的目標細菌無標記檢測。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，按照如下步驟進行：

1)制備聚乙烯亞胺的Fe₃O₄磁性納米粒：通過改進的溶膠-熱反應合成超順磁性Fe₃O₄納米粒，將制備好的超順磁性Fe₃O₄納米粒與聚乙烯亞胺溶液等體積混合，超聲30min，聚乙烯亞胺逐漸自組裝在磁性Fe₃O₄納米粒表面，去離子水沖洗三次，在4℃保存備用；

2)將1毫升的金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌菌液中加入適配子共同孵育20分鐘；

3)加3μL聚乙烯亞胺的Fe₃O₄磁性納米粒到步驟2)混合液中孵育,在室溫下以800rpm速度搖動10分鐘，隨后，磁性收集Fe₃O₄@PEI-細菌-適配體復合物，PBS緩沖液(10mM,pH 7.4)洗滌2次；

4)聚乙烯亞胺的Fe₃O₄磁性納米粒-細菌-適配體復合物被轉移到埃普多夫管,加入100μL 10mM硝酸銀溶液,漩渦1分鐘，然后在埃普多夫管中加入100μL NaBH₄再漩渦1分鐘；

5)聚乙烯亞胺的Fe₃O₄磁性納米粒-細菌-適配體@Ag被磁富集并滴在硅基片上進行SERS光譜的測量。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟2)中細菌特異性核酸適配體的濃度為300nM。

4.根據權利要求2-3所述的方法，其特征在于，所述步驟5)采用正交偏最小二乘判別分析化學計量學方法準確觀察不同細菌的指紋SERS圖譜的差異。