[發明專利]一種阿司匹林藥物相關基因基因多態性檢測的引物組、試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 201910277368.5
• 申請日: 2019-04-08
• 公開（公告）號: CN110066868A
• 公開（公告）日: 2019-07-30
• 發明（設計）人: 田曉麗
• 申請（專利權）人: 大連美納醫學檢驗實驗室有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 大連至誠專利代理事務所(特殊普通合伙) 21242
• 代理人: 涂文詩;馬玉戈

本發明公開了一種阿司匹林藥物相關基因基因多態性檢測的引物組、試劑盒及檢測方法，本發明公開了一種能夠用于快速、靈敏、有效的檢測(GPIIIa、PEAR1)基因多態性的引物組，并利用這些引物開發出用于檢測阿司匹林用藥基因(GPIIIa、PEAR1)基因多態性的方法和試劑盒。本發明公開的引物組、試劑盒及檢測方法具有靈敏度高、特異性強、方法簡單、結果準確等特點。

技術領域

本發明涉及生物技術及醫學領域，更具體地，涉及一種阿司匹林藥物相關基因基因多態性檢測的引物組、試劑盒及檢測方法。

背景技術

阿司匹林是治療急性冠狀動脈綜合征和經皮冠狀動脈介入術后抗栓的基礎藥物，廣泛應用于心腦血管疾病一級和二級預防。臨床發現部分患者盡管長期低劑量服用阿司匹林仍不能有效抑制血小板的活性，即阿司匹林抵抗，其發生率約50％～60％，且存在明顯種族差異性。研究表明，基因多態性在阿司匹林抵抗中起著重要作用，主要集中在GPIIIaP1A1/A2、PEAR1基因多態性。

GPIIIa P1A2是阿司匹林抵抗主要基因，該基因突變使GPIIb/IIIa受體結構發生改變，使血小板之間發生交叉連接，導致血小板聚集。研究發現，發生阿司匹林抵抗患者攜帶P1A2等位基因的頻率明顯高于阿司匹林敏感患者，且 P1A2/A2純合突變型患者服用阿司匹林后療效均不理想。攜帶突變型P1A2等位基因患者行支架術后，其亞急性血栓事件發生率是P1A1純合野生型患者的5倍，需要更高劑量的阿司匹林才能達到抗凝效果。

PEAR1是參與血小板激活途徑的一種橫跨細胞膜的分子，它的磷酸化作用可以促進血小板的聚集。研究發現，PEAR1的rs12041331基因多態性變化與患者的抗血小板治療反應性密切相關，其中，PEAR1GG等位基因型患者對阿司匹林應答效果好，AA或AG基因型患者支架植入術后服用阿司匹林，其發生心肌梗死和死亡率高。

因此，建議在使用阿司匹林前，檢測GPIIIa P1A1/A2和PEAR1，臨床藥師將針對患者基因型對患者進行療效預測，并對高風險患者提前干預，以降低患者用藥風險，保障臨床用藥安全、有效。

關于基因突變檢測方法有很多，各國學者對此都進行了大量研究。己經報道的方法包括直接測序法、DHPLC(denaturing high performance liquid chromatography，變性高效液相色譜分析)、PCR(聚合酶鏈式反應)-SSCP(單鏈構象多態性)/RFLP(限制性片段長度多態性)、Scorpions ARMS(蝎形探針擴增阻滯突變系統)、TaqMan PCR法、ME-PCR法等。這些方法各有優缺點，其中在臨床和科研中較為常用的方法為直接測序法以及ARMS(Amplification refractory mutation system,擴增阻滯突變系統)法。

直接測序法檢測能力有限，其檢測靈敏度約20％左右，而且步驟復雜，整個檢測過程涉及PCR-電泳-測序-測序結果的解讀等一系列的步驟，費時費力，但是該方法的優點是能夠發現一些新的未知突變。

ARMS方法是將分子信標(探針)與特異性的ARMS引物相結合創造出來的， ARMS引物3’端設計在突變位點，最后一個堿基與突變堿基配對，釆用無3’→5’外切酶活性的TaqDNA聚合酶，特異性的識別引物的3’末端，只有引物 3’末端完全配對時，才能正常擴增，當引物3’末端發生錯配時，不能有效的擴增。當引物與突變模板結合并延伸出相應的產物后，探針兩端的熒光基團和淬滅基團分離而產生熒光。目前，市場上相關試劑盒包括QIAGEN公司和廈門艾德公司，價格昂貴。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術存在的上述缺陷，提供一種阿司匹林藥物相關基因基因多態性檢測的引物組、試劑盒及檢測方法，釆用ARMS技術與 SYBR染料相結合的方法，該方法靈敏度高，特異性強，方法簡單，結果準確，且檢測成本大大降低。

為實現上述目的，本發明的技術方案如下：