[發(fā)明專利]一種小片段stat1a/stat1b基因雙突變?nèi)笔桶唏R魚

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910275901.4
• 申請(qǐng)日: 2019-04-08
• 公開（公告）號(hào): CN110172481A
• 公開（公告）日: 2019-08-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳湘定;萬(wàn)思瑤;王焱;鄧云;鄧紅文;譚麗君;廖美
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 湖南師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/90
• 分類號(hào): C12N15/90;C12N15/85;A01K67/027
• 代理公司: 長(zhǎng)沙新裕知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 43210
• 代理人: 周躍仁

一種小片段stat1a/stat1b基因雙突變?nèi)笔桶唏R魚，該斑馬魚獲得方法包括如下步驟：CRISPR/Cas9基因敲除靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)構(gòu)建表達(dá)載體以及體外合成；斑馬魚胚胎的顯微注射；T7E1法和Sanger測(cè)序檢測(cè)靶位點(diǎn)的有效性；注射兩個(gè)月之后，進(jìn)行剪尾鑒定；目的序列的TA克隆；質(zhì)粒的Sanger測(cè)序；獲得可遺傳的斑馬魚突變體的F1代；獲得斑馬魚突變體的F2代純合子；依據(jù)步驟九方法進(jìn)行stat1a基因缺失型斑馬魚的F3代純系遺傳，得到stat1a?17的斑馬魚純合品系；篩選stat1b基因突變?nèi)笔桶唏R魚；篩選stat1a/stat1b基因雙突變?nèi)笔桶唏R魚。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及CRISPR/Cas9基因打靶領(lǐng)域，特別涉及一種小片段 stat1a/stat1b基因雙突變?nèi)笔桶唏R魚。

背景技術(shù)

STAT1(signal transducer and activator of transcription 1)基因位于人類2q32.3，是編碼750個(gè)氨基酸的轉(zhuǎn)錄因子。一般認(rèn)為該基因介導(dǎo)干擾素信號(hào)通路，可直接調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，并參與細(xì)胞增殖與分化等過程。通過基因差異表達(dá)譜分析和基因組關(guān)聯(lián)分析等，發(fā)現(xiàn)STAT1 基因與骨質(zhì)疏松密切相關(guān)。

斑馬魚與人類在骨骼發(fā)育過程中的基因、信號(hào)通路有高度同源性，且STAT1基因進(jìn)化上較為保守，人類STAT1基因的兩個(gè)不同剪接體 STAT1-alpha和STAT1-beta對(duì)應(yīng)于斑馬魚兩個(gè)不同基因stat1a和 stat1b，研究發(fā)現(xiàn)stat1b和stat1b在斑馬魚胚胎早期表達(dá)量特別高。而且，與其他動(dòng)物模型相比，斑馬魚個(gè)體小、幼魚通體透明，利于骨骼發(fā)育的觀察。

通過CRISPR/Cas9基因打靶技術(shù)，分別在斑馬魚stat1a和stat1b 基因上設(shè)計(jì)合適的打靶位點(diǎn)，將體外合成的特異性sgRNA(終濃度 20ng/μL)和Cas9-mRNA(終濃度300ng/μL)顯微共注射進(jìn)斑馬魚一細(xì)胞內(nèi)，并通過活性檢測(cè)證實(shí)了所選位點(diǎn)的有效性。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種小片段stat1a/stat1b基因雙突變?nèi)笔桶唏R魚。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：

一種小片段stat1a/stat1b基因雙突變?nèi)笔桶唏R魚，該斑馬魚獲得方法包括如下步驟：

步驟一、CRISPR/Cas9基因敲除靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)

在NCBI上查詢斑馬魚stat1a基因的基因組DNA序列及其功能結(jié)構(gòu)域,根據(jù)CRISPR/Cas9敲除原理，設(shè)計(jì)一對(duì)stat1a基因的靶位點(diǎn)，靶點(diǎn)的選擇遵循此標(biāo)準(zhǔn)：5'-GG-(N)18-NGG-3'：其中5'端的二核普酸是T7啟動(dòng)子的一部分,靶位點(diǎn)的3'端是NGG；

步驟二、構(gòu)建表達(dá)載體以及體外合成

步驟三、斑馬魚胚胎的顯微注射

在受精30min后之內(nèi)，用吸管吸取胚胎轉(zhuǎn)移至用瓊脂糖制作的顯微注射專用培養(yǎng)皿中；在進(jìn)行顯微注射之前,將Cas9 mRNA和gRNA 配成混合液,充分混勻,使Cas9 mRNA的終濃度為300ng/μL，gRNA 的終濃度為20ng/μL，注射1.8nLCas9 mRNA和gRNA混合液于一細(xì)胞期的受精卵內(nèi),注射過的受精卵放置于置于5mmol/L NaCl、 0.33mmol/L CaCl2、0.33mmol/L MgSO4、0.17mmol/L KCl的E3水中,28℃孵化，在體視顯微鏡下觀察胚胎表型，篩選正常發(fā)育的胚胎用于靶位點(diǎn)突變分析；

步驟四、T7E1法和Sanger測(cè)序檢測(cè)靶位點(diǎn)的有效性