[發明專利]一種小片段stat1a/stat1b基因雙突變缺失型斑馬魚

在審

• 申請號: 201910275901.4
• 申請日: 2019-04-08
• 公開（公告）號: CN110172481A
• 公開（公告）日: 2019-08-27
• 發明（設計）人: 陳湘定;萬思瑤;王焱;鄧云;鄧紅文;譚麗君;廖美
• 申請（專利權）人: 湖南師范大學
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N15/85;A01K67/027
• 代理公司: 長沙新裕知識產權代理有限公司 43210
• 代理人: 周躍仁

1.一種小片段stat1a/stat1b基因雙突變缺失型斑馬魚，其特征在于，該斑馬魚獲得方法包括如下步驟：

步驟一、CRISPR/Cas9基因敲除靶位點設計

在NCBI上查詢斑馬魚stat1a基因的基因組DNA序列及其功能結構域,根據CRISPR/Cas9敲除原理，設計一對stat1a基因的靶位點，靶點的選擇遵循此標準：5'-GG-(N)18-NGG-3'：其中5'端的二核普酸是T7啟動子的一部分,靶位點的3'端是NGG；

步驟二、構建表達載體以及體外合成

步驟三、斑馬魚胚胎的顯微注射

在受精30min后之內，用吸管吸取胚胎轉移至用瓊脂糖制作的顯微注射專用培養皿中；在進行顯微注射之前,將Cas9 mRNA和gRNA配成混合液,充分混勻,使Cas9 mRNA的終濃度為300ng/μL，gRNA的終濃度為20ng/μL，注射1.8nLCas9 mRNA和gRNA混合液于一細胞期的受精卵內,注射過的受精卵放置于置于5mmol/L NaCl、0.33mmol/L CaCl2、0.33mmol/L MgSO4、0.17mmol/L KCl的E3水中,28℃孵化，在體視顯微鏡下觀察胚胎表型，篩選正常發育的胚胎用于靶位點突變分析；

步驟四、T7E1法和Sanger測序檢測靶位點的有效性

對斑馬魚胚胎進行顯微注射之后,挑選部分發育正常的早期胚胎,使用T7E1對純化回收DNA目的片段按一定的比例進行酶切實驗，檢測目的DNA片段是否被切開；如若目的DNA片段下面有被切開的條帶，則使用ImageJ軟件，通過酶切后條帶的亮度來估計非同源末端連接的頻率；這樣可以檢測其stat1a基因是否存在突變，提前確認此次選擇的靶位點是否有效果，顯微注射操作是否規范；另外，送部分純化之后的目的DNA片段進行Sanger測序，由測序的峰圖來初步獲得插入或缺失的信息；若測序峰圖有雙峰，并且測序結果顯示有插入或缺失現象的目的序列，則說明注射F0代的斑馬魚有突變的情況出現，進一步確認了靶位點及此次注射的有效性，接下來將剩余的斑馬魚胚胎養大成成魚即可進行F0代突變體篩選工作；

步驟五、注射兩個月之后，進行剪尾鑒定；

步驟六、目的序列的TA克隆

T7E1酶切初步鑒定有突變可能的目的序列再進行Sanger測序：若測序峰圖有雙峰，并且測序結果顯示有插入或缺失現象的目的序列，接下來進行克隆之后挑取單克隆作進一步檢測；

步驟七、質粒的Sanger測序

將雙酶切檢測結果顯示條帶中目的條帶有被切開的質粒送往測序，根據測序之后給出的峰圖和序列，在NCBI上與標準目的序列進行對比，根據比對結果，分析出每個單克隆的突變類型；

步驟八、獲得可遺傳的斑馬魚突變體的F1代

通過前面一系列篩選確定了斑馬魚突變體F0代，緊接著將F0代突變體分別與野生型斑馬魚雜交得到F1代胚胎,置于28℃培養，在初期觀察F1代的存活率；受精兩天后，每個突變體F1代分別取10個胚胎進行突變遺傳性鑒定；將每個胚胎單獨提取基因組,然后PCR擴增出700bp的靶位點附近區域，再進行T7E1酶切分析并送部分去測序，確定此突變是否可以遺傳到后代；

步驟九、獲得斑馬魚突變體的F2代純合子

從F1代突變體中挑選相同突變的雌魚和雄魚，雜交得到F2代, 放置于28℃培養，受精四天后取部分胚胎進行鑒定；將每個胚胎單獨提取基因組,PCR擴增出700bp靶位點附近區域，通過BalI限制性酶切分析并測序，初步檢驗是否可以得到stat1a突變體純合子；如檢驗結果證明存在純合子，則養大后再單條剪尾鑒定；

步驟十、依據步驟九方法進行stat1a基因缺失型斑馬魚的F3代純系遺傳，得到stat1a-17的斑馬魚純合品系；

步驟十一、篩選stat1b基因突變缺失型斑馬魚

根據篩選stat1a基因突變缺失型斑馬魚同樣的步驟，同樣對stat1b基因進行CRISPR/Cas9基因敲除，通過篩選，獲得stat1b基因缺失型斑馬魚的F3代純系遺傳，得到stat1b-S2的斑馬魚純合品系；

步驟十二、篩選stat1a/stat1b基因雙突變缺失型斑馬魚

將stat1a-17 F5代突變純合體斑馬魚與stat1b-S2 F3代突變純合體斑馬魚進行雜交，依據步驟八、步驟九的方法最終獲得stat1a/stat1b基因雙突變缺失型斑馬魚的F3代純系遺傳，得到stat1a/stat1b基因雙突變缺失型斑馬魚純合品系。