[發明專利]一種獲得非轉基因多年生黑麥草突變體的方法

有效

• 申請號: 201910275840.1
• 申請日: 2019-04-08
• 公開（公告）號: CN111850029B
• 公開（公告）日: 2022-04-26
• 發明（設計）人: 冉毅東;高崑;張康;張韞瑋
• 申請（專利權）人: 天津吉諾沃生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/10;C12N15/113;C12N15/29;C07K14/415;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 白艷

本發明公開了一種獲得非轉基因多年生黑麥草突變體的方法。本發明提供了一種培育目標非轉基因黑麥草突變體的方法，包括如下步驟：1)通過CRISPR/Cas9系統抑制多年生黑麥草中黑麥草減數分裂蛋白編碼基因LpDMC1的表達，得到轉化后黑麥草植株；2)將所述轉化后黑麥草植株進行PCR/RE實驗，選取酶切過程中未切開條帶且測序為有效突變的單株為突變后黑麥草植株；3)選取所述突變后黑麥草植株中不含有Cas9基因的單株，為目標非轉基因黑麥草突變體；本發明CRISPR/Cas核酸酶技術得到DMC1的敲除突變體，同源染色體之間不能正常配對組裝形成二價體,這樣就能夠獲得不育的植株的單價體，子代雜交就能形成單倍體，能夠快速的縮短育種年限，在作物育種改良上起到顯著的作用。

技術領域

本發明涉及生物工程領域，尤其涉及獲得非轉基因多年生黑麥草突變體的方法。

背景技術

多年生黑麥草(Loliumperenne L.)是世界上最重要的牧草和草坪草，對黑麥草基因組的改造有利于黑麥草基因組的研究，對提高其生物、非生物脅迫和畜牧業的發展有重要意義。目前國內國際對黑麥草突變體的創制主要以EMS誘變為主，但這些方法費時費力，盲目性較大。當前的植物基因組工程(Genome engineering)技術中，主要通過鋅指核酸酶(ZFNs)和轉錄激活子樣效應因子核酸酶(TALENs)來做基因改造，但是這些技術操作過程復雜，成本高，技術難度較大。因此，亟待開發更加高效、廉價并且簡單的黑麥草基因改造新技術。

DMC1基因是減數分裂過程中特異表達的基因，僅在減數分裂前期I表達，是減數分裂過程中重組和聯會復合體形成的關鍵基因。

發明內容

為了培育目標非轉基因黑麥草突變體，本發明提供了如下技術方案：

本發明提供了一種培育目標非轉基因黑麥草突變體的方法，包括如下步驟：

1)通過CRISPR/Cas9系統抑制多年生黑麥草中黑麥草減數分裂蛋白編碼基因LpDMC1的表達，得到轉化后黑麥草植株；

2)將所述轉化后黑麥草植株進行聚合酶鏈反應-限制性內切酶分析(PCR/RE)實驗，選取酶切過程中未切開條帶且測序為有效突變的單株為突變后黑麥草植株；

有效突變為測序后缺失或者添加非3的倍數個堿基(即發生移碼突變)；

3)選取所述突變后黑麥草植株中不含有Cas9基因的單株，為目標非轉基因黑麥草突變體；

所述黑麥草減數分裂蛋白為如下(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)SEQ ID NO:4所示；

(a2)將(a1)經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白質；

(a3)與(a1)具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且具有相同功能的蛋白質；

所述CRISPR/Cas9系統包括Cas9蛋白和特異sgRNA；

所述特異sgRNA的靶序列為如下(b1)或(b2)：

(b1)SEQ ID NO:1所示；

(b2)與(b1)具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性的核酸分子。

上述方法中，所述特異sgRNA為如下(c1)或(c2)：

(c1)SEQ ID NO:1編碼的RNA；

(c2)與(c1)具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性的核酸分子。