[發(fā)明專利]一種獲得非轉(zhuǎn)基因多年生黑麥草突變體的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910275840.1
• 申請日: 2019-04-08
• 公開（公告）號: CN111850029B
• 公開（公告）日: 2022-04-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 冉毅東;高崑;張康;張韞瑋
• 申請（專利權(quán)）人: 天津吉諾沃生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/10;C12N15/113;C12N15/29;C07K14/415;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 白艷

1.一種培育目標(biāo)非轉(zhuǎn)基因黑麥草突變體的方法，包括如下步驟：

1）通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)抑制多年生黑麥草中黑麥草減數(shù)分裂蛋白編碼基因LpDMC1的表達(dá)，得到轉(zhuǎn)化后黑麥草植株；

2）將所述轉(zhuǎn)化后黑麥草植株進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)-限制性內(nèi)切酶分析實驗，選取酶切過程中未切開條帶且測序為有效突變的單株為突變后黑麥草植株；

3）選取所述突變后黑麥草植株中不含有Cas9基因的單株，為目標(biāo)非轉(zhuǎn)基因黑麥草突變體；

所述黑麥草減數(shù)分裂蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；

步驟1）所述CRISPR/Cas9系統(tǒng)包括Cas9蛋白和特異sgRNA；

所述特異sgRNA的靶序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

步驟2）所述聚合酶鏈反應(yīng)-限制性內(nèi)切酶分析實驗的PCR擴(kuò)增引物對由引物1和引物2組成；

所述引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

步驟3）所述選取所述突變后黑麥草植株中不含有Cas9基因的單株為用Cas9基因擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選取未得到目的片段的單株；

所述Cas9基因擴(kuò)增引物由引物3和引物4組成；

所述引物3的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；

所述引物4的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：

所述通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)抑制黑麥草中黑麥草減數(shù)分裂蛋白編碼基因LpDMC1的表達(dá)為向目的植物中導(dǎo)入所述Cas9蛋白的編碼基因和所述特異sgRNA的編碼DNA分子，得到轉(zhuǎn)化后黑麥草植株。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：

所述向目的植物中導(dǎo)入所述Cas9蛋白的編碼基因和所述特異sgRNA的編碼DNA分子是向所述目的植物中導(dǎo)入表達(dá)Cas9蛋白的基因的質(zhì)粒和表達(dá)特異sgRNA的質(zhì)粒。

4.一種sgRNA或表達(dá)其的質(zhì)粒，所述sgRNA的靶序列的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。

5.權(quán)利要求4所述sgRNA在制備黑麥草突變體中的應(yīng)用。

6.權(quán)利要求1-3所述方法在黑麥草育種中的應(yīng)用。