[發(fā)明專利]一株鈣離子通道CchA基因失活的黑曲霉基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910271574.5
• 申請(qǐng)日: 2019-04-04
• 公開（公告）號(hào): CN110106095B
• 公開（公告）日: 2020-08-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳勇;劉麗;應(yīng)漢杰;余斌;孫文俊;楊樂(lè)云;王芳娟;歐陽(yáng)平凱
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/15
• 分類號(hào): C12N1/15;C12N15/90;C12P7/48;C12R1/685
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務(wù)所 32237
• 代理人: 胡建華

本發(fā)明公開了一株鈣離子通道CchA基因失活的黑曲霉基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，它是敲除鈣離子通道CchA基因的黑曲霉菌。本發(fā)明還公開了上述基因工程菌的構(gòu)建方法。進(jìn)一步公開了基因工程菌在生產(chǎn)檸檬酸中的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建基因敲除鈣離子通道CchA基因的黑曲霉基因工程菌，使黑曲霉在固定化發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸過(guò)程中生物膜產(chǎn)量降低并且疏水性降低，減輕了載體的抱團(tuán)現(xiàn)象，提高了檸檬酸產(chǎn)量和糖轉(zhuǎn)化效率，適宜于工業(yè)生產(chǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程及微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種敲除鈣離子通道CchA基因的黑曲霉基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

檸檬酸作為全世界需求量最大的有機(jī)酸之一，被廣泛用于食品、醫(yī)藥、日化等行業(yè)。其中，75％的檸檬酸被用于食品工業(yè)，主要用于食品添加劑中的酸味劑、抗氧劑、pH調(diào)節(jié)劑，同時(shí)由于檸檬酸具有溫和爽快的酸味，普遍用于飲料、糕點(diǎn)、葡萄酒、乳制品等食品的制造。另外有15％是用于化工和紡織業(yè)，可以用作緩沖液、絡(luò)合劑、掩蔽劑、金屬助洗劑、媒染劑等等。還有10％的檸檬酸被用作抗凝血?jiǎng)⒔馑崴帯⒊C味劑、化妝品以及飼料添加劑等等，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥工業(yè)以及畜牧業(yè)中。近些年來(lái)，由于我國(guó)糧食價(jià)格普遍上漲，隨之而來(lái)的就是檸檬酸生產(chǎn)原料成本的大幅上漲。因此如何改進(jìn)檸檬酸發(fā)酵方法并且進(jìn)一步降低成本就成了我國(guó)整個(gè)檸檬酸產(chǎn)業(yè)最為關(guān)心的問(wèn)題。

黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)檸檬酸是當(dāng)前工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的主要途徑之一，通過(guò)細(xì)胞固定化的方法可以大幅提升黑曲霉的發(fā)酵效率。目前，細(xì)胞固定化的方法主要有四種：包埋法、交聯(lián)法、共價(jià)結(jié)合法以及吸附法。對(duì)于絲狀真菌來(lái)說(shuō)，吸附法操作簡(jiǎn)單，固定過(guò)程不需要化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變，而且理論上適用于所有絲狀真菌，更利于在工業(yè)上的推廣和應(yīng)用。吸附法的原理主要是依靠載體表面的基團(tuán)和細(xì)胞表面的相互作用力，進(jìn)而促使細(xì)胞吸附在載體表面進(jìn)行生長(zhǎng)。并且當(dāng)細(xì)胞衰亡之后會(huì)從載體上脫落，同時(shí)有活性的細(xì)胞再吸附上去，形成一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，使整個(gè)微環(huán)境形成一個(gè)高效的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，整體發(fā)酵效率與游離發(fā)酵相比有明顯的提升。在人們對(duì)固定化發(fā)酵機(jī)理的研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，微生物普遍會(huì)在載體上形成生物膜，并且所形成的生物膜不同會(huì)導(dǎo)致固定化發(fā)酵的性能發(fā)生很大的差異。因此，我們需要對(duì)生物膜形成機(jī)制進(jìn)一步的了解，才能真正解決固定化工業(yè)應(yīng)用難的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容

為解決現(xiàn)有工業(yè)上黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸時(shí)產(chǎn)量低，發(fā)酵周期長(zhǎng)的問(wèn)題，本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供一株鈣離子通道CchA基因缺陷型的黑曲霉基因工程菌。

本發(fā)明還要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供上述產(chǎn)檸檬酸黑曲霉基因工程菌的構(gòu)建方法。

本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供上述黑曲霉基因工程菌在發(fā)酵產(chǎn)檸檬酸中的應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一株鈣離子通道CchA基因失活的黑曲霉基因工程菌，它是通過(guò)雙交換方法，利用hyg抗性基因替換掉CchA基因部分序列的基因工程菌，鈣離子通道CchA基因參與菌絲主軸極性生長(zhǎng)，產(chǎn)孢以及細(xì)胞壁的完整性。細(xì)胞壁完整性能夠影響生物膜的生成，因此，鈣離子通道CchA基因能夠調(diào)控生物膜的生成，從而影響檸檬酸的產(chǎn)量。

其中，所述黑曲霉為Aspergillus Niger 831(A.niger 831)，

所述鈣離子通道CchA基因失活前核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述鈣離子通道CchA基因失活后核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一種鈣離子通道CchA基因失活的黑曲霉基因工程菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

(1)提取黑曲霉A.niger 831的基因組DNA；

(2)以步驟(1)得到的基因組為模板，以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列為引物，擴(kuò)增出CchA基因的上游同源臂；