[發明專利]一株鈣離子通道CchA基因失活的黑曲霉基因工程菌及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 201910271574.5
• 申請日: 2019-04-04
• 公開（公告）號: CN110106095B
• 公開（公告）日: 2020-08-04
• 發明（設計）人: 陳勇;劉麗;應漢杰;余斌;孫文俊;楊樂云;王芳娟;歐陽平凱
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C12N15/90;C12P7/48;C12R1/685
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 胡建華

1.鈣離子通道CchA基因失活的黑曲霉基因工程菌在固定化發酵制備檸檬酸中的應用，其特征在于，所述黑曲霉為Aspergillus Niger 831；

所述鈣離子通道CchA基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，鈣離子通道CchA基因失活后的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述的固定化發酵是以多孔纖維材料作為固定化介質，發酵制備檸檬酸。

2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的黑曲霉基因工程菌按照如下方法構建：

(1) 提取黑曲霉Aspergillus Niger 831的基因組DNA；

(2) 以步驟（1）得到的基因組DNA為模板，以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列為引物，擴增出CchA基因的上游同源臂；

以步驟（1）得到的基因組為模板，以SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列為引物，擴增出CchA基因的下游同源臂；

以質粒pan7-1為模板，以SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列為引物，擴增出hyg抗性元件；

通過overlap PCR，以CchA基因的上游同源臂、CchA基因的下游同源臂、hyg抗性元件為模板，以SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列為引物，PCR擴增得到基因敲除片段；

(3) 制備黑曲霉原生質體；

(4) 將基因敲除重組片段導入原生質體中進行同源重組，得到鈣離子通道CchA基因失活的黑曲霉基因工程菌，所述的鈣離子通道CchA基因失活后的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述固定化發酵的培養條件如下：培養溫度為28℃~37℃，培養時間為72~120h轉速為180~330rpm。

4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述固定化發酵的發酵培養基的配置方法如下：

分別取200g/L~300g/L木薯粉、200g/L-300g/L的玉米粉，在60℃-70℃下，每1L發酵液加入1~2mL的液化酶，酶解35min~45min，再將木薯粉液和玉米粉液分別加熱至達85℃，每1L發酵液加入1~2mL的液化酶，酶解35min~45min，直至碘液不變藍，過濾木薯粉液，得木薯粉液上清，向木薯粉液上清中加入并加入體積分數為2-10%的未過濾的玉米粉液，混勻得到固定化發酵培養基，所述液化酶中含有α-淀粉酶，所述α-淀粉酶的酶活為60000~70000U/mL。

5.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述多孔纖維材料為活性炭纖維。

6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述的多孔纖維材料先用以下方法進行預處理：

將多孔纖維材料用1 M的氫氧化鈉浸泡1~1.5h，再用水沖洗至 pH 為中性，在1M鹽酸中浸泡1~1.5h，再用水沖洗至 pH 為中性，烘干至恒重，得到改性多孔纖維材料。