[發(fā)明專利]核桃乳真?zhèn)涡缘腜CR-HRM分子鑒定方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910271057.8
• 申請日: 2019-04-04
• 公開（公告）號: CN109971838A
• 公開（公告）日: 2019-07-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 丁艷菲;姜廣澤;朱誠;陳成統(tǒng);王飛娟;孫駿威;江瓊
• 申請（專利權(quán)）人: 中國計量大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851
• 代理公司: 杭州恒翌專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 33298
• 代理人: 王從友

本發(fā)明篩選得到了psba?trnH作為鑒定核桃乳的最適DNA條形碼。基于此，設(shè)計了針對核桃的特異性引物對，制備了相關(guān)試劑盒，并利用它們對核桃乳的真?zhèn)涡赃M(jìn)行鑒定。本發(fā)明的鑒定方法準(zhǔn)確快速，應(yīng)用范圍廣，具有良好市場應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及領(lǐng)域分子鑒定領(lǐng)域，尤其涉及鑒定核桃乳的DNA條形碼基因及核桃真?zhèn)涡缘姆肿予b定方法。

背景技術(shù)

核桃乳不僅具有純天然的植物蛋白原材料、不失核桃仁原有營養(yǎng)成份和增強(qiáng)大腦記憶功能的特點(diǎn)，還是蛋白質(zhì)、維生素B、尼克酸以及多種微量元素的良好來源，在我國一直屬于暢銷產(chǎn)品[1-2]。然而，核桃乳摻雜使假現(xiàn)象層出不窮，手段和方式不斷翻新，檢測和鑒定困難重重，因過敏源成分不明對消費(fèi)者的人身健康構(gòu)成威脅，影響了食品安全和貿(mào)易秩序。

目前食品真?zhèn)涡缘蔫b定主要依賴于蛋白質(zhì)和DNA序列分析[3-4]。核桃乳作為深加工食品，經(jīng)高溫等流程，DNA破壞嚴(yán)重，不適合蛋白質(zhì)分析[5]。DNA條形碼技術(shù)是利用一段或幾段標(biāo)準(zhǔn)DNA序列實(shí)現(xiàn)動物、植物和真菌物種快速鑒定的方法，以一對通用引物擴(kuò)増標(biāo)準(zhǔn)序列，通過序列內(nèi)堿基的多樣性可以對己知和未知成分進(jìn)行識別，具有范圍廣、特異性好、靈敏度高、操作簡便的優(yōu)點(diǎn)[6-8]。常用于植物DNA條形碼的基因有ITS、rbcl、trnl、paba-trnH，它們被認(rèn)為是潛在的優(yōu)秀的植物DNA條形碼候選序列。目前，DNA條形碼技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食品鑒定領(lǐng)域[9-13]。

近年來DNA條形碼，克服了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類存在的缺陷，被廣泛應(yīng)用于物種鑒定及食品安全領(lǐng)域。Maralita等利用DNA條形碼鑒定了菲律賓市場上的漁類產(chǎn)品，發(fā)現(xiàn)金槍魚與標(biāo)簽不符[17]。Jaakola等通過DNA條形碼和HRM分析技術(shù)，對來自不同野生漿果品種且在市場上易混淆的歐洲越橘進(jìn)行鑒定[18]。Bruni等使用DNA條形碼技術(shù)鑒定了3個集合植物樣本，證明DNA條形碼技術(shù)是一種有效的有毒植物鑒定工具[19]。

我國植物蛋白飲料市場日益增大，原成分造假現(xiàn)象較為嚴(yán)重。目前DNA條形碼技術(shù)也應(yīng)用于植物蛋白飲料的鑒定領(lǐng)域。韓晴等[16]研究發(fā)現(xiàn)ITS2-2和trnH-psbA-1可作為鑒別杏仁露中花生源性成分的植物DNA條形碼組合，為植物蛋白飲料的檢測提供了新思路。核桃乳的加工工藝復(fù)雜，從而使得其DNA難以提取。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述問題，本發(fā)明中分別用ITS1、ITS2、rbcL、psbA-trnH、trnL 5種DNA條形碼基因?qū)?0種核桃乳DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測及產(chǎn)物送測序，通過對比擴(kuò)增效率及測序結(jié)果，篩選得到核桃乳最適mini條形碼psbA-trnH。本發(fā)明基于DNA條形碼技術(shù)，結(jié)合HRM熒光定量PCR，對市售10種核桃乳目的種源成分(核桃)與非目的種源成分進(jìn)行真?zhèn)涡詸z測。對10種核桃乳采用了熒光定量PCR和HRM分析技術(shù)，發(fā)現(xiàn)一款摻假核桃乳產(chǎn)品，其可作為非測序的快速核桃乳真?zhèn)舞b定有效方法。因此，DNA條形碼技術(shù)還可以與熒光定量PCR、基因芯片技術(shù)等技術(shù)相結(jié)合達(dá)到對食品更準(zhǔn)確、更快速的鑒別，成為食品物種來源鑒定的重要工具。

本發(fā)明的一個目的是提供一種鑒定核桃乳的DNA條形碼基因，其特征在于，該基因的序列如SEQ ID NO:13所示。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種鑒定核桃乳的DNA條形碼基因，其特征在于，該基因的序列如SEQ ID NO:14所示。

本發(fā)明的另一個目的是提供用于擴(kuò)增鑒定核桃乳的DNA條形碼基因的引物對，其特征在于，所述引物對為SEQ ID NO:7和8所示。

本發(fā)明的另一個目的是提供用于擴(kuò)增鑒定核桃乳的DNA條形碼基因的引物對，其特征在于，所述引物對為SEQ ID NO:11和12所示。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于鑒定核桃乳真?zhèn)涡缘脑噭┖校涮卣髟谟冢渲泻蠸EQ ID NO:7和8的引物對，或者含有SEQ ID NO:11和12的引物對，或者含有SEQID NO:7、8；以及11和12的引物對。