[發明專利]核桃乳真偽性的PCR-HRM分子鑒定方法在審
| 申請號： | 201910271057.8 | 申請日： | 2019-04-04 |
| 公開（公告）號： | CN109971838A | 公開（公告）日： | 2019-07-05 |
| 發明（設計）人： | 丁艷菲;姜廣澤;朱誠;陳成統;王飛娟;孫駿威;江瓊 | 申請（專利權）人： | 中國計量大學 |
| 主分類號： | C12Q1/6851 | 分類號： | C12Q1/6851 |
| 代理公司： | 杭州恒翌專利代理事務所(特殊普通合伙) 33298 | 代理人： | 王從友 |
| 地址： | 310018 浙江省*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 核桃乳 真偽性 特異性引物 應用范圍廣 分子鑒定 市場應用 試劑盒 制備 核桃 篩選 | ||
1.一種鑒定核桃乳真偽性的PCR-HRM分子鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟：
（1）從待鑒定核桃乳樣本中分離提取DNA；
（2）以步驟（1）所得DNA和標準品核桃DNA為模板，采用SEQ ID NOs:7和8的引物對進行熒光定量PCR擴增；
（3）對熒光定量PCR的擴增曲線圖進行高分辨率熔解曲線（HRM）分析，單一物種擴增后的熔解曲線為單峰，而摻假樣品會出現不同熔解溫度的明顯雙峰。
2.權利要求1的方法，進一步包括如下步驟：
（4）熒光定量PCR擴增產物進一步用凝膠電泳驗證判斷，單一條帶的是核桃乳純樣本；兩條條帶恰好也對應熔解曲線雙峰的樣本，是摻假樣本。
3.一種鑒定核桃乳真偽性的PCR-HRM分子鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟：
（1）從待鑒定核桃乳樣本中分離提取DNA；
（2）以步驟（1）所得DNA和標準品核桃DNA為模板，采用SEQ ID NOs:7和8的引物對進行熒光定量PCR擴增；
（3）擴增后連續進行HRM分析，比較核桃乳DNA曲線與目的種源成分核桃以及非目的種源成分的熔解曲線的異同，判定是否存在摻假，并確定摻假物種。
4.權利要求1-3任一項的方法，其中步驟（2）中的PCR擴增反應條件為：Holding：95℃30s、cycle：40；二步法：95℃5s，60℃30s。
5.20 μL的擴增體系中依次加入10 μL SYBR(zx)、0.4 μL rox、0.8 μL引物、2 μL DNA模板、6 μL無菌去離子水。
6.權利要求4的方法，其中PCR擴增體系為：20 μL的擴增體系中依次加入10 μL SYBR(zx)、0.4 μL rox、0.8 μL引物、2 μL DNA模板、6 μL無菌去離子水。
7.權利要求1-3、5任一項的方法，其中高分辨率熔解曲線反應條件：緊密遵循高分辨率熔化，從75℃到95℃，溫度增量為每2秒0.1℃。
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