[發明專利]一種可控永生化的逆轉錄病毒載體和人臍帶間充質干細胞及其構建方法

在審

• 申請號: 201910267989.5
• 申請日: 2019-04-03
• 公開（公告）號: CN110106201A
• 公開（公告）日: 2019-08-09
• 發明（設計）人: 張嬌;鄒翠云;張蓓;江福能;鐘惟德;朱建國
• 申請（專利權）人: 廣州輝園苑醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867
• 代理公司: 廣州容大專利代理事務所(普通合伙) 44326
• 代理人: 劉新年

本發明屬于生物技術領域，具體涉及了一種可控永生化的逆轉錄病毒載體和人臍帶間充質干細胞及其構建方法。所述的構建方法，借助Tet?on 3G系統構建含永生化因子的可控永生化逆轉錄病毒載體，包裝逆轉錄病毒感染臍帶間充質干細胞，通過添加誘導物誘導永生化因子基因的表達，將其轉化為具有高增殖能力的永生化細胞；當需要將細胞用于正常生理或疾病治療時，撤銷誘導物，永生化因子基因處于轉錄關閉狀態，細胞回復原代臍帶間充質干細胞特性，在基因功能研究或是疾病治療中都具有十分重要的意義。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種可控永生化的逆轉錄病毒載體和人臍帶間充質干細胞及其構建方法。

背景技術

人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUMSCs)是一類來源于中胚層具有多向分化潛能的基質細胞，免疫原性低且具有免疫調控功能，在基因治療和細胞替代治療、免疫性疾病方面有著廣泛的臨床應用前景。然而，hUMSCs與機體其他正常細胞一樣，經過有限次的細胞傳代后，出現細胞停止增殖，發生衰老和死亡，即細胞老化現象(cell senescence)。研究顯示，hUMSCs在體外培養約10-30代左右出現細胞老化，這就阻礙了hUMSCs在臨床應用和機制方面的研究。若可以將hUMSCs永生化，使其能夠避免細胞培養過程中出現老化、干性消失，保持多潛能分化狀態，不僅能為細胞生物學的研究提供穩定性狀，在基因治療、細胞治療等研究方面也具有潛在的應用價值。

細胞永生化是指細胞自發或受體外因素影響能克服增殖危機，具有無限增殖的能力。1998年，Bodnar和Ouellette等將人端粒酶逆轉錄酶基因(human telomerase reversetranscriptase，TERT)轉染到原代視網膜色素上皮細胞和成纖維細胞中，細胞壽命至少延長了20倍。2003年，Cui將TERT基因轉染到綿羊成纖維細胞中，攜帶TERT基因的成纖維細胞能夠連續培養500天以上，未攜帶TERT基因組只能連續培養200天左右。因此，通過轉入外源性的永生化基因TERT來獲得細胞永生化狀態。目前也有通過將重組到慢病毒載體的TERT基因轉染hUMSCs使其延長壽命的方法，但是轉化的細胞會在細胞表型或代謝方式上和原代分離的細胞有所差異。另外，將病毒轉化的細胞連續不可控的表達永生化因子TERT的細胞模型替代原代細胞進行研究存在潛在的風險性，會使它在細胞治療、基因治療等臨床應用中受到限制。

四環素誘導表達系統由強啟動子、四環素反應元件和四環素類小分子誘導劑構成，其中Tet-On系統的調節蛋白為反義四環素轉錄激活子，在無誘導物的情況下能持續保持外源基因轉錄關閉的狀態，當存在誘導物時，外源基因轉錄被激活。Tet-On系統中，不存在誘導物時，反式轉錄活化因子(rtTA)仍會少量的結合TRE，造成一定的背景表達。

在基因治療領域，常見的外源基因遞送載體有非整合型載體和逆轉錄病毒載體，但是非整合型載體的轉染效率取決于細胞種類及轉染試劑，并且只能在細胞核外暫時表達，導致永生化效率偏低。攜帶永生化因子的逆轉錄病毒轉化的臍帶間充質干細胞，能夠持續不可控的表達永生化因子TERT，使其在臨床應用中有潛在的風險性，會使它在細胞治療、基因治療中受到限制。另外，Tet-On 3G系統只有在添加誘導物的情況下，才能誘導表達永生化因子TERT，但是不能將外源基因整合到細胞基因組。

可見，現有技術亟待改進。

發明內容

鑒于此，有必要針對上述問題提供一種可控永生化的逆轉錄病毒載體和人臍帶間充質干細胞及其構建方法，以克服現有永生化臍帶間充質干細胞構建的缺陷，能較好的解決永生化因子TERT連續不可控的表達帶來的不安全性。

本發明通過以下技術方案實現的：

一種可控永生化臍帶間充質干細胞的構建方法，操作包括：

(S1)借助Tet-on 3G系統構建含永生化因子TERT的可控永生化逆轉錄病毒載體；