[發(fā)明專利]一種可控永生化的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞及其構(gòu)建方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910267989.5
• 申請日: 2019-04-03
• 公開（公告）號: CN110106201A
• 公開（公告）日: 2019-08-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張嬌;鄒翠云;張蓓;江福能;鐘惟德;朱建國
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州輝園苑醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867
• 代理公司: 廣州容大專利代理事務(wù)所(普通合伙) 44326
• 代理人: 劉新年

1.一種可控永生化臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的構(gòu)建方法，其特征在于，操作步驟包括：

(S1)構(gòu)建含永生化因子的可控永生化逆轉(zhuǎn)錄病毒載體；

(S2)包裝步驟(S1)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，感染臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；

(S3)通過添加誘導(dǎo)物調(diào)控TERT基因的表達(dá)，將其轉(zhuǎn)化為具有高增殖能力的永生化細(xì)胞。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述構(gòu)建方法，其步驟(S1)的具體操作包括：

S11：以攜帶有PTRE3G啟動子序列的質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增PTRE3G啟動子序列插入到pUC19載體質(zhì)粒，PTRE3G啟動子序列如序列表中SEQ ID NO：1所示；

S12：以攜帶有TERT基因的質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增TERT基因插入到pUC19-PTRE3G載體質(zhì)粒的PTRE3G啟動子序列下游，TERT基因序列如序列表中SEQ ID NO：2所示；

S13：以攜帶有PuroR基因、T2A基因的質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增PuroR基因和T2A基因插入到pCMV-TetON3G載體質(zhì)粒，PuroR和T2A基因序列分別如序列表中SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5所示；

S14：以步驟S12中獲得的重組質(zhì)粒pUC19-PTRE3G-TERT為模板，PCR擴(kuò)增PTRE3G-TERT基因插入到pCLXSN載體質(zhì)粒；

S15：以步驟S13中獲得的重組質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增CMV-PuroR-T2A-TetON3G-SV40poly(A)signal基因定向插入到pCLXSN-PTRE3G-TERT載體質(zhì)粒，構(gòu)建的重組質(zhì)粒攜帶了CMV基因、T2A基因序列、TetON3G基因SV40 poly(A)signal基因和KanR序列，分別如序列表中SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8所示；

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述構(gòu)建方法，其步驟(S2)的具體操作包括：

S21：將步驟S1中的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝，濃縮病毒液后進(jìn)行病毒滴度檢測；

S22：將攜帶TERT基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染原代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，嘌呤霉素篩選得到穩(wěn)定的細(xì)胞系。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述嘌呤霉素濃度為0.2μg/mL。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟(S3)中調(diào)控永生化因子基因的表達(dá)，具體包括：向培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)物，誘導(dǎo)表達(dá)；當(dāng)需要將細(xì)胞用于正常生理或疾病治療時(shí)，撤銷誘導(dǎo)物，永生化因子基因處于轉(zhuǎn)錄關(guān)閉狀態(tài)，細(xì)胞回復(fù)原代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞特性。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)物為四環(huán)素類藥物。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述四環(huán)素類藥物為強(qiáng)力霉素或地美環(huán)素或米諾霉素或金霉素或土霉素或四環(huán)素。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)物的誘導(dǎo)濃度為0.2μg/mL。

9.一種可控永生化逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其特征在于，所述載體攜帶有PTRE3G啟動子(SEQID NO：1)、TERT基因(SEQ ID NO：2)、PuroR基因(SEQ ID NO：4)、T2A基因(SEQ ID NO：5)、CMV啟動子(SEQ ID NO：3)、TetON3G基因(SEQ ID NO：6)、SV40 poly(A)signal基因(SEQ IDNO：7)、KanR元件(SEQ ID NO：8)。