[發明專利]一種貓血巴爾通氏體SYBR Green I熒光PCR檢測方法及引物

在審

• 申請號: 201910267851.5
• 申請日: 2019-04-03
• 公開（公告）號: CN110317888A
• 公開（公告）日: 2019-10-11
• 發明（設計）人: 鄒豐才;段博芳;呂艷;楊建發;曾邦權;趙煥云
• 申請（專利權）人: 云南農業大學;云南省動物疫病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/04;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

本發明屬基因檢測技術領域，涉及一種貓血巴爾通氏體SYBR Green I熒光PCR檢測方法及引物，包括以下步驟：提取貓血液中全基因組DNA，設計引物，引物稀釋，優化反應條件，繪制溶解度曲線，繪制標準曲線，檢測特異性，測定變異系數，驗證及結果分析。本發明檢測方法優點在于建立了不用核酸探針即可檢測的PCR技術，簡單、快速、價格低廉，在一般的實驗室即可實現，與傳統的普通PCR方法相比較，這種方法無需對PCR產物進行凝膠電泳分析，可避免產物引起模板污染，而且可實時觀察反應來判讀結果，在一定程度上避免了傳統PCR容易產生的假陽性結果。

技術領域

本發明屬基因檢測技術領域，涉及一種貓血巴爾通氏體SYBR Green I熒光PCR檢測方法及引物。

背景技術

貓血巴爾通體病是一類由寄生蟲引起的疾病，又稱貓的傳染性貧血。其致病微生物一般與支原體形態相似，而與血巴爾通體不同。貓血巴爾通氏體是介于細菌和立克次體之間的一種微生物，為立克次體目，無漿體科，血巴爾通體屬。病原體呈球狀、桿狀或環狀，大小不一。一般在紅細胞表面，有時游離于血漿中。瑞氏染色的血片中，菌體呈藍黑色或紫色。

SYBR Green I熒光PCR：指特異性結合雙鏈DNA的燃料，結合雙鏈DNA后熒光增強1000倍左右，且對DNA雙鏈結構具有穩定作用，能對PCR擴增產物進行連續監測。

目前，針對貓血巴爾通氏體病原學檢測技術有普通PCR和熒光探針PCR檢測。普通PCR敏感性低于熒光探針PCR，且不能定量DNA的拷貝量。熒光探針PCR，它將探針技術和PCR技術有機結合在一起，通過PCR產物中的DNA含量來定量分析檢測樣本中目的DNA或mRNA的含量，但探針價格昂貴，不利于普通實驗室常規檢測，無法滿足實際需求。

發明內容

本發明的目的是為了提供一種簡單、快速、價格低廉，在一般的實驗室即可實現，與傳統的普通PCR方法相比較，無需對PCR產物進行凝膠電泳分析，可避免產物引起模板污染，而且可實時觀察反應來判讀結果，可以在極大程度上避免了傳統PCR容易產生的假陽性結果的檢測方法。

為了達到上述目的，本發明采用了以下技術方案：

一種貓血巴爾通氏體SYBR Green I熒光PCR檢測引物，所述引物序列如下：

F-2a：5'-GAA TAA GTG ACA GCW AAC TAT-3'；

R-2b:5'-ATA TCT ACR CAT TCC ACC GCT-3'；

一種貓血巴爾通氏體SYBR Green I熒光PCR檢測方法，包括以下步驟：

(一)提取提取貓血液中全基因組DNA；

(二)設計引物：針對貓血液中貓血巴爾通氏體病原體16S rRNA基因，找到其保守區，設計SYBR Green I熒光擴增引物；

(三)使用滅菌超純水將步驟(二)中引物稀釋；

(四)優化反應條件；

(五)根據步驟(四)優化反應條件循環結束后的結果繪制溶解度曲線；

(六)繪制標準曲線；

(七)檢測特異性：分別對豬附紅細胞體鏡檢陽性、犬血巴爾通氏體和鼠血巴爾通氏體合成其16S rRNA序列進行檢測，以評價其特異性；

(八)測定變異系數：對同一陽性標準品設2個重復管，用優化的實時熒光定量PCR條件對陽性標準品進行檢測，評價其重復性，計算組內變異系數；將該標準陽性樣本置于-20℃冰箱保存，貓血巴爾通氏體SYBR Green I熒光定量PCR檢測方法的建立于保存后第1周、2周和第3周重檢，以評價其再現性，計算其組間變異系數；