[發明專利]一種貓血巴爾通氏體SYBR Green I熒光PCR檢測方法及引物

在審

• 申請號: 201910267851.5
• 申請日: 2019-04-03
• 公開（公告）號: CN110317888A
• 公開（公告）日: 2019-10-11
• 發明（設計）人: 鄒豐才;段博芳;呂艷;楊建發;曾邦權;趙煥云
• 申請（專利權）人: 云南農業大學;云南省動物疫病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/04;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種貓血巴爾通氏體SYBR Green I熒光PCR檢測引物，其特征在于，所述引物序列如下：

F-2a：5'-GAA TAA GTG ACA GCW AAC TAT-3'；

R-2b:5'-ATA TCT ACR CAT TCC ACC GCT-3'。

2.一種貓血巴爾通氏體SYBR Green I熒光PCR檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

(一)提取提取貓血液中全基因組DNA；

(二)設計引物：針對貓血液中貓血巴爾通氏體病原體16S rRNA基因，找到其保守區，設計SYBR Green I熒光擴增引物；

(三)使用滅菌超純水將步驟(二)中引物稀釋；

(四)優化反應條件；

(五)根據步驟(四)優化反應條件循環結束后的結果繪制溶解度曲線；

(六)繪制標準曲線；

(七)檢測特異性：分別對豬附紅細胞體鏡檢陽性、犬血巴爾通氏體和鼠血巴爾通氏體合成其16S rRNA序列進行檢測，以評價其特異性；

(八)測定變異系數：對同一陽性標準品設2個重復管，用優化的實時熒光定量PCR條件對陽性標準品進行檢測，評價其重復性，計算組內變異系數；將該標準陽性樣本置于-20℃冰箱保存，貓血巴爾通氏體SYBR Green I熒光定量PCR檢測方法的建立于保存后第1周、2周和第3周重檢，以評價其再現性，計算其組間變異系數；

(九)SYBR Green I熒光PCR檢測方法的驗證：將收集的貓抗凝血液樣本提取核酸后進行用SYBR Green I熒光PCR方法檢測血液中貓血巴爾通氏體是否陽性。

3.根據權利要求2所述的一種貓血巴爾通氏體SYBR Green I熒光PCR檢測方法，其特征在于：所述步驟(一)中，提取貓血液中全基因組DNA步驟：

①將冰凍的血液樣本在室溫下溶化；

②取1ml血液轉入一無菌的2ml離心管中，加入等體積的PBS磷酸鹽緩沖液，充分混勻后12000rpm離心5min，棄上清；

③加入667μl STE，24μl的20％的SDS，37℃水浴1h；

④加10μl的20mg/ml的蛋白酶K混勻，55℃水浴消化過夜(10～14h)；⑤將消化的樣品加入等體積的Tris飽和酚，充分搖勻，12000rpm離心10min；

⑥將上層水相轉入另一無菌2ml離心管中；再加入等體積的Tris飽和酚，充分搖勻，12000rpm離心10min；

⑦將上層水相轉入另一無菌2ml離心管中；并加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，旋渦振蕩至充分混勻，12000rpm離心10min；

⑧將上層水相轉入另一無菌2ml離心管中；并加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，充分振蕩混勻，12000rpm離心10min；

⑨將上清液轉移到另一無菌2ml離心管中；加入2倍體積的冰乙醇，1/10體積醋酸鈉水平搖動，直到可見絮狀DNA析出；

⑩將樣品置-20℃冰箱冷凍30min或冰浴15～20min，取出后再次12000rpm離心10min，使DNA沉淀；

用槍頭將DNA挑到另一無菌離心管中，用適量的70％乙醇洗滌并晃動，以洗出DNA的雜質；

倒出乙醇，將DNA用真空干燥或自然晾干，加入適量的TE緩沖液回溶，-20℃保存備用。

4.根據權利要求2所述的一種貓血巴爾通氏體SYBR Green I熒光PCR檢測方法，其特征在于：所述步驟(三)中，使用滅菌超純水稀釋引物的方法為：使用滅菌超純水稀釋引物，上下游引物濃度為50pmol/μL,分裝后置-20℃保存。

5.根據權利要求2所述的一種貓血巴爾通氏體SYBR Green I熒光PCR檢測方法，其特征在于：所述步驟(四)中優化反應條件為：采用2×Super Real PreMix Plus(with SYBRGreen I)推薦的25μL反應體系，以出現最高的熒光值ΔRn、最小的Ct值以及在熔解曲線中不出現非特異性峰為指標，對退火溫度(55～65℃)進行優化。