[發明專利]轉基因玉米品系DAS40278-9檢測方法和試劑

在審

• 申請號: 201910266719.2
• 申請日: 2019-04-03
• 公開（公告）號: CN109825632A
• 公開（公告）日: 2019-05-31
• 發明（設計）人: 潘廣;凌杏園;章桂明;劉新嬌;向才玉;盧小雨;李芳榮;楊帆
• 申請（專利權）人: 深圳出入境檢驗檢疫局食品檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6851
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司 44281
• 代理人: 李小焦;彭家恩

本申請公開了一種轉基因玉米品系DAS40278?9檢測方法和試劑。本申請的檢測方法，包括在PCR反應體系中同時加入玉米品系DAS40278?9外源基因和HMG基因的特異引物和探針，并加入礦物油，混勻制成微滴，在微滴中進行雙重ddPCR，反應結束后，讀取每個微滴擴增信號，計算品系外源基因和HMG的拷貝數；其中，品系外源基因和HMG基因的探針分別用FAM和HEX標記。本申請檢測方法，設計配套使用的內源基因HMG和品系特異性引物探針，采用雙通道法，分別定量兩者在玉米基因組的拷貝數，計算轉基因玉米品系DAS40278?9絕對含量，對玉米轉基因成分研究和進出境玉米產品轉基因成分精準定量檢測有重要意義。

技術領域

本申請涉及轉基因玉米檢測領域，特別是涉及一種轉基因玉米品系DAS40278-9檢測方法和試劑。

背景技術

隨著生物技術產業的迅速發展，全球轉基因作物的研發速度和種植面積持續增加。推進轉基因技術已經成為了著眼于未來的發展戰略和解決糧食短缺、確保國家糧食安全的必然選擇。但是轉基因生物安全問題也隨之成為世界關注的熱點。目前世界各國出于經濟、衛生、環保等各種目的紛紛對轉基因生物及其產品加強管理和檢測。包括中國在內的50個左右國家和地區相繼頒布并實行了“轉基因標識制度”，對轉基因生物及其加工產品進行標識和管理。近年來，隨著各國有關GMO(GeneticallyModified organism)標簽法的建立和不斷完善，對食品中的GMO含量下限已有所規定。很多國家不但要求對轉基因食品進行定性檢測，還需要對食品中的GMO含量進行定量檢測，以便標識。其標識的閾值一般在0.9％–5％之間(European Commission,2003；Notification,2000)。建立轉基因產品的檢測技術標準尤其是精準定量檢測技術是實施轉基因產品標識的技術前提。因此，轉基因成分的精準定量技術將隨著全世界標識制度的完善和發展日趨重要。

現階段應用最廣的定量檢測方法是實時熒光PCR(qPCR)，但穩定性、準確性差，所以需要更加精準的檢測方法進行替代。數字PCR(dPCR)是在熒光PCR基礎上發展起來的基因定量技術，用于核酸的絕對拷貝數檢測。dPCR通過將常規的熒光PCR反應體系等量均分為相互隔離的大數量微反應體系，通常等量均分為10000個以上的微反應體系，使每個模板獨立隨機分配至微反應體系中，同時在相同的規定條件下進行PCR擴增反應，根據設定的熒光值判斷每個微反應體系的檢測結果。最后以實驗的陽性與陰性結果的比率進行泊松分布分析，獲得熒光PCR反應體系中的模板濃度。與傳統qPCR相比，dPCR存在有以下優勢:(1)qPCR結果判定依賴擴增曲線的Ct值，容易受到外界影響；而dPCR結果判定不依賴于擴增曲線，只需要判定擴增信號的有無，就可以對樣品進行判定，穩定性遠強于qPCR；(2)qPCR容易受到基質中抑制因子的影響；而dPCR通過將反應體系進行分割，可以弱化PCR抑制因子對反應結果的影響，從而提高結果判定的穩定性和準確性。

目前，數字PCR(dPCR)在科學研究方面已經取得了很大的研究進展，其在臨床診斷、拷貝數鑒定、絕對定量等方面取得了很多科研成果。Taly等(2013)利用微滴式數字PCR(ddPCR)技術檢測直腸癌病人環狀DNA的KRAS突變基因，最終實現了包括野生型的多重樣品檢測。在植物源制品的檢測研究中，Burns等(2010)評估了數字PCR的檢測限(LOD)和定量限(LOQ)，探索了數字PCR在檢測方面的可行性和反應條件，文章表明數字PCR能夠對起始模板拷貝數進行絕對定量。總體而言，dPCR技術目前更多地應用于醫學診斷方面，已成為臨床應用方面最具潛力的診斷技術之一，并在其它行業取得了突破性研究進展。但是，在轉基因檢測的研究方面，數字PCR還處于起始階段，特別是在我國乃至全球各國的標準層面都暫無涉及，這極大制約了數字PCR在實際檢測工作上的應用。

研究顯示，按照種植面積統計，全球約35％的玉米都是轉基因產品；然而國際、國內對轉基因玉米的特異性定性或定量檢測方法卻相當缺乏，尤其是對轉基因玉米品系DAS40278-9的定量檢測，尚未有相關的研究或報道。因此，亟需研究一種有效的轉基因玉米品系DAS40278-9檢測方法。

發明內容