[發明專利]一種通氣懸浮培養細胞生產積藥草黃酮的方法

在審

• 申請號: 201910262121.6
• 申請日: 2019-04-02
• 公開（公告）號: CN109928946A
• 公開（公告）日: 2019-06-25
• 發明（設計）人: 曹劍鋒;趙云艷;孟艷;吳超
• 申請（專利權）人: 貴州師范學院
• 主分類號: C07D311/30
• 分類號: C07D311/30;C07D311/40;C12N5/04
• 代理公司: 貴陽東圣專利商標事務有限公司 52002
• 代理人: 袁慶云

本發明公開了一種通氣懸浮培養細胞生產積藥草黃酮的方法，包括以下步驟:取積藥草嫩枝或嫩葉作為外植體進行植物組織培養，待愈傷組織長出后，選擇色澤鮮艷、活力旺盛的愈傷組織塊，采用酶解法分離制備種子細胞；將收集到的種子細胞接種到含有改良MS液體培養基A的搖瓶中，搖床震蕩培養，當細胞密度達到7000?10000個/mL，即可放大培養，收集細胞和濾液；在細胞中加入乙醇溶液,提取積藥草細胞黃酮粗提物；將濾液濃縮后加入乙醇，室溫浸提,減壓回收乙醇，過濾,濾液干燥后得到褐色干提取物為積藥草培養液黃酮粗提物；合并積藥草細胞黃酮粗提物和積藥草培養液黃酮粗提物即得積藥草總黃酮粗提物；分離純化即得。本發明細胞培養周期短，產品收率高，工藝簡單穩定，適合工業化生產。

技術領域

本發明屬于醫藥技術領域，特別涉及一種通氣懸浮培養細胞生產積藥草黃酮的方法。

背景技術

積藥草為檀香科植物百蕊草Thesium chinense Turcz.的別名.又名百乳草(《本草圖經》)，地石榴(《貴州民間方藥集》)，小草(《全展選編內科》) 等。積藥草為檀香科多年生半寄生草本植物，春、夏季采集曬干全草入藥，為我國民間常用中草藥。味苦澀, 性溫，具有顯著抗炎、解暑、鎮痛和廣譜抗菌作用，被稱為“植物抗生素”。積藥草植株較小，種子小、種殼堅硬，在自然條件下萌發困難，繁殖能力差；野生資源較少，為目前急缺的廣譜抗菌中草藥。積藥草黃酮是積藥草的主要成分之一，傳統積藥草黃酮的提取方法是用積藥草植株的莖、葉等植物體提取所得，由于資源所限，現有的野生資源及從中提取黃酮類成分已難以滿足市場的需求，因此尋找一條資源供給的新興途徑，已經變得非常必要。

發明內容

本發明的目的在于提供一種細胞培養周期短，產品收率高，工藝簡單穩定，適合工業化生產的通氣懸浮培養細胞生產積藥草黃酮的方法。

本發明的一種通氣懸浮培養細胞生產積藥草黃酮的方法，包括以下步驟:

（1）種子細胞制備

取積藥草嫩枝或嫩葉作為外植體在改良MS固體培養基上進行植物組織培養，待愈傷組織長出后，選擇色澤鮮艷、活力旺盛的愈傷組織塊，按照每4g組織塊加入100ml的濃度為50-100mg/L果膠酶溶液，采用酶解法分離制備種子細胞，用100-300目微孔濾器過濾，濾液經1000rpm/min離心機分離，收集沉淀下的種子細胞；

（2）種子細胞系培養

將收集到的種子細胞接種到含有改良MS液體培養基A的搖瓶中，鮮細胞接種量為28±2g/L，pH值為5.8±0.2，培養溫度為20-28℃，培養時間為1-15天，光照時間為10-24h，光強度為2000-40001ux，搖床震蕩培養，當細胞密度達到7000-10000個/mL，即可放大培養；

（3）細胞放大培養

將種子細胞系培養好的種子細胞系接種于含有改良MS液體培養基B的氣升式攪拌發酵罐中，培養溫度為20-28℃，培養時間為15-25天，光照時間為10-24h，光照強度為2000-10000Lux，氣升攪拌懸浮培養調節通氣速率和攪拌速率維持溶氧在30%，調節pH值為5.8±0.2；當細胞密度達到60000-100000個/mL停止培養，采用1000rpm/min低速離心或過濾法收集細胞和濾液；

（4）提取積藥草黃酮

取10g細胞, 加入體積濃度為60%的乙醇溶液100 ml,提取溫度為80℃，提取時間為2.5h，得積藥草細胞黃酮粗提物；將濾液濃縮至原體積的1/10后加入乙醇至乙醇體積濃度達60%后，室溫浸提12h,減壓回收乙醇，過濾,濾液在溫度為40℃、壓力為10O-13Opa下干燥24-48小時后得到褐色干提取物為積藥草培養液黃酮粗提物；合并積藥草細胞黃酮粗提物和積藥草培養液黃酮粗提物即得積藥草總黃酮粗提物；