[發(fā)明專利]一種通氣懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)積藥草黃酮的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910262121.6
• 申請(qǐng)日: 2019-04-02
• 公開（公告）號(hào): CN109928946A
• 公開（公告）日: 2019-06-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曹劍鋒;趙云艷;孟艷;吳超
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 貴州師范學(xué)院
• 主分類號(hào): C07D311/30
• 分類號(hào): C07D311/30;C07D311/40;C12N5/04
• 代理公司: 貴陽東圣專利商標(biāo)事務(wù)有限公司 52002
• 代理人: 袁慶云

1.一種通氣懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)積藥草黃酮的方法，包括以下步驟:

（1）種子細(xì)胞制備

取積藥草嫩枝或嫩葉作為外植體在改良MS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行植物組織培養(yǎng)，待愈傷組織長(zhǎng)出后，選擇色澤鮮艷、活力旺盛的愈傷組織塊，按照每4g組織塊加入100ml的濃度為50-100mg/L果膠酶溶液，采用酶解法分離制備種子細(xì)胞，用100-300目微孔濾器過濾，濾液經(jīng)1000rpm/min離心機(jī)分離，收集沉淀下的種子細(xì)胞；

（2）種子細(xì)胞系培養(yǎng)

將收集到的種子細(xì)胞接種到含有改良MS液體培養(yǎng)基A的搖瓶中，鮮細(xì)胞接種量為28±2g/L，pH值為5.8±0.2，培養(yǎng)溫度為20-28℃，培養(yǎng)時(shí)間為1-15天，光照時(shí)間為10-24h，光強(qiáng)度為2000-40001ux，搖床震蕩培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到7000-10000個(gè)/mL，即可放大培養(yǎng)；

（3）細(xì)胞放大培養(yǎng)

將種子細(xì)胞系培養(yǎng)好的種子細(xì)胞系接種于含有改良MS液體培養(yǎng)基B的氣升式攪拌發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度為20-28℃，培養(yǎng)時(shí)間為15-25天，光照時(shí)間為10-24h，光照強(qiáng)度為2000-10000Lux，氣升攪拌懸浮培養(yǎng)調(diào)節(jié)通氣速率和攪拌速率維持溶氧在30%，調(diào)節(jié)pH值為5.8±0.2；當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60000-100000個(gè)/mL停止培養(yǎng)，采用1000rpm/min低速離心或過濾法收集細(xì)胞和濾液；

（4）提取積藥草黃酮

取10g細(xì)胞, 加入體積濃度為60%的乙醇溶液100 ml,提取溫度為80℃，提取時(shí)間為2.5h，得積藥草細(xì)胞黃酮粗提物；將濾液濃縮至原體積的1/10后加入乙醇至乙醇體積濃度達(dá)60%后，室溫浸提12h,減壓回收乙醇，過濾,濾液在溫度為40℃、壓力為10O-13Opa下干燥24-48小時(shí)后得到褐色干提取物為積藥草培養(yǎng)液黃酮粗提物；合并積藥草細(xì)胞黃酮粗提物和積藥草培養(yǎng)液黃酮粗提物即得積藥草總黃酮粗提物；

（5）純化: 將總黃酮粗提物用徑高比1:10聚酰胺柱，洗脫溶劑為70%乙醇溶液，洗脫溶劑量為2倍柱體積，分離純化即得。

2.如權(quán)利要求1所述的一種通氣懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)積藥草黃酮的方法，其中：改良MS固體培養(yǎng)基是在MS基本培養(yǎng)基中加入6-芐氨基嘌呤0.1-1mg/L.萘乙酸1.0-5.0 mg/L , 2，4-二氯苯氧乙酸0.1-1.0mg/L , 果膠酶50-100m個(gè)/L，蔗糖30g/L，瓊脂5g/L。

3.如權(quán)利要求1所述的一種通氣懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)積藥草黃酮的方法，其中：改良MS液體培養(yǎng)基A是在MS培養(yǎng)基中加入萘乙酸1.0-5.0mg/L, 6-芐氨基嘌呤1.0-5.0mg/L，蔗糖20-30g/L。

4.如權(quán)利要求1所述的一種通氣懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)積藥草黃酮的方法，其中：改良MS液體培養(yǎng)基B是在培養(yǎng)基為 MS基本培養(yǎng)基加入萘乙酸1.0-5.0mg/L,6-芐氨基嘌呤1.0-5.0mg/L ,果膠酶50-100mg/L, 蔗糖20-30g/L，硝酸銀1-40mM。