[發明專利]一種檢測蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼蟲芽孢桿菌的雙重PCR檢測方法

有效

• 申請號: 201910258230.0
• 申請日: 2019-04-01
• 公開（公告）號: CN109825618B
• 公開（公告）日: 2022-11-22
• 發明（設計）人: 黃嫦嬌;張體銀;邵碧英;陳彬
• 申請（專利權）人: 福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/07;C12R1/01
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊;饒文君

本發明提供一種檢測蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼蟲芽孢桿菌的雙重PCR檢測方法，用于蜜蜂及蜂產品中蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼蟲芽孢桿菌檢測。本發明方法對蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼蟲芽孢桿菌的檢測具有高度特異性，相互之間及與其它蜜蜂致病菌無交叉反應，且重復性好；檢測兩種致病菌的靈敏度均能達到約1 pg/μL；整個操作不需要昂貴的儀器和試劑，一次操作可以同時檢測兩種病原，全部反應在2個小時內完成。本發明為蜜蜂及蜂產品中蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼蟲芽孢桿菌的快速檢測提供了新的技術手段，對于保護國內蜂群的健康安全和促進蜂產品國際貿易的健康發展具有重要的現實意義和實際應用價值。

技術領域

本發明涉及一種檢測蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼蟲芽孢桿菌的雙重PCR檢測方法，屬于生物技術領域，適用于蜜蜂及蜂產品中蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼蟲芽孢桿菌檢測。

背景技術

蜜蜂美洲幼蟲腐臭病（American foulbrood，AFB）和歐洲幼蟲腐臭病 （Europeanfoulbrood，EFB）是兩種能引起蜜蜂幼蟲死亡的細菌性、急性、毀滅性傳染病，能導致蜜蜂幼蟲的大批死亡，最終導致整個蜂群的滅亡，危害巨大。農業部和質檢總局聯合制定的最新的《中華人民共和國進境動物檢疫疫病名錄》將二者列為二類傳染病。世界動物衛生組織（OIE）也將其列入檢疫名錄，列為進出口蜜蜂及蜂產品檢疫對象。

美洲幼蟲腐臭病是目前危害蜜蜂幼蟲生長的最主要細菌病之一，輕者降低蜂群繁殖和采集力，重者導致蜂群的覆滅。該病傳播迅速、為害嚴重，發生后就很難治愈，難以根除，而且經常復發，尤其是1日齡的蜜蜂幼蟲對幼蟲芽孢桿菌非常敏感，一旦感染很快就會死亡。

歐洲幼蟲腐臭病是一種蜜蜂幼蟲的惡性傳染病，傳播快、危害大，可引起幼蟲大批死亡。患病蜂群不能正常采蜜和繁殖，蜂群減弱甚至覆沒。通過流行病學調查，目前沒有發現哪一種蜜蜂對歐洲幼蟲腐臭病有抵抗力，東方蜜蜂比西方蜜蜂更易感染，尤其中蜂發病更為嚴重。

美洲幼蟲腐臭病的病原體為蜜蜂幼蟲芽孢桿菌（Paenibacillus Larvae，PL），是一種芽孢形式的革蘭氏陽性細菌。產生的芽孢有7層結構包圍，這種特殊構造使得幼蟲芽孢桿菌的芽孢具有特別強的生命力，對熱、化學物質等有極強的抵抗力，在高溫干燥等惡劣環境下至少能存活35年。懸浮在蜂蜜中的芽孢陽光照射下能存活4周-6周。幼蟲芽孢桿菌這種對外界環境超強的抵抗力使得他可在蜂蜜、蜂王漿、蜂膠和蜂花粉中存活很長時間。蜜蜂歐洲幼蟲腐臭病是由蜂房蜜蜂球菌（Melissococcus pluton，MP）引起的，該菌是一種革蘭氏陽性菌，但有染色特性不穩定性，有時候可能為革蘭氏陰性菌，兼性厭氧。蜂房蜜蜂球菌對外界不良環境有特別強的抵抗力，在巢脾或蜂蜜內能存活1年左右，在室溫和干燥條件下可存活17個月，也可在蜂蜜、蜂王漿、蜂膠和蜂花粉中存活，可以通過蜜蜂和蜂產品傳播。

近年來，隨著蜜蜂和蜂產品的國際貿易逐漸增多，由此帶來的蜜蜂疫病安全問題日益受到各方關注。

我國對蜂病的研究不多，除對蜜蜂重要疫病生物學、流行病學及蜂群疫病診斷方面開展一些研究外，而對于蜂產品中蜂類病原的檢測研究幾乎是空白。根據原國家質檢總局的要求，今后要加強蜂產品中蜂類病原的檢測，尤其是對蜜蜂美洲幼蟲腐臭病和歐洲幼蟲腐臭病加強檢疫，以防蜂病通過產品傳入國內。

針對進口蜂產品的檢測，目前主要集中在藥物殘留、生產加工衛生和摻假等質量安全方面的問題，尤其是對抗生素殘留和生產加工過程中的人為污染控制嚴格，而對于蜂產品中可能攜帶的蜂類病原缺少足夠的重視。由于對蜜蜂使用抗生素的控制，一些衛生管理條件不好的養蜂場由于管理不善而導致蜂類疫病流行，而有些病原可以通過蜂蜜等產品進行傳播，這就加大了病原傳入的風險。同時由于近年來蜂產品進口量越來越大，其中相當一部分為未加工的蜂蜜原料，傳播蜂病的可能性更高。因此，非常有必要對進口蜂產品實施蜂類疫病檢測，制訂有效的檢測方法。