[發明專利]一種檢測蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼蟲芽孢桿菌的雙重PCR檢測方法

有效

• 申請號: 201910258230.0
• 申請日: 2019-04-01
• 公開（公告）號: CN109825618B
• 公開（公告）日: 2022-11-22
• 發明（設計）人: 黃嫦嬌;張體銀;邵碧英;陳彬
• 申請（專利權）人: 福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/07;C12R1/01
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊;饒文君

1.一種非疾病診斷治療目的的檢測蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼蟲芽孢桿菌的雙重PCR檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）雙重PCR反應體系配置：2×PCR Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L用于擴增蜂房蜜蜂球菌特異片段的上下游引物MP-F和MP-R各0.5 μL，10 μmol/L用于擴增蜜蜂幼蟲芽孢桿菌特異片段的上下游引物PL-F和PL-R各0.75 μL，待測樣品DNA 2 μL，然后加入去離子水8.0 μL，使反應總體積為25.0 μL；

（2）雙重PCR反應程序：95 ℃預變性 3 min；95 ℃ 變性45 s，64 ℃ 退火30 s，72 ℃變性45 s，共35個循環；72 ℃ 延伸5 min，4 ℃保溫；

（3）PCR擴增產物檢測分析與判定：取8 μL PCR擴增產物，在加入0.01% GelRed核酸染料的1.5%瓊脂糖凝膠上電泳后，在凝膠成像系統上檢測PCR擴增產物后進行結果判定：

當所述雙重PCR擴增產物中含有大小為401 bp的條帶，則所述待測樣品含有蜂房蜜蜂球菌；

當所述雙重PCR擴增產物中含有大小為706 bp的條帶，則所述待測樣品含有蜜蜂幼蟲芽孢桿菌；

當所述雙重PCR擴增產物中同時含有大小為401 bp的條帶和706 bp的條帶，則所述待測樣品同時含有蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼蟲芽孢桿菌；

用于擴增蜂房蜜蜂球菌特異片段的上游引物MP-F、下游引物MP-R和擴增蜜蜂幼蟲芽孢桿菌特異片段的上游引物PL-F、下游引物PL-R，各引物核苷酸序列如下：

上游引物MP-F：5’-AGAAGAGTGGCGGACGGGTGA-3’；

下游引物MP-R：5’-ACCGTCACGAGGAAAACAGTTACTC-3’；

上游引物PL-F：5’-GCCAAGGAAGAACGGCCAGGG-3’；

下游引物PL-R：5’-CCACCTCTGCGTGCTGGCAA-3’。