[發(fā)明專利]一種骨髓來源的破骨細胞培養(yǎng)方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201910257672.3
• 申請日: 2019-04-01
• 公開（公告）號: CN109810941A
• 公開（公告）日: 2019-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李偉東;陸金蘭;謝輝;吳麗;夏晨潔;周雅倩
• 申請（專利權(quán)）人: 南京中醫(yī)藥大學(xué)
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077;A61K35/32;A61P19/10
• 代理公司: 北京精金石知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11470
• 代理人: 強紅剛

本發(fā)明公開了一種骨髓來源的破骨細胞培養(yǎng)方法，屬于細胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。該方法是將已提取的骨髓用分離液處理后獲得單核細胞，清洗后將所得的單核細胞加完全培養(yǎng)基和巨噬細胞集落刺激因子(M?CSF)，接種于96孔板中，于第二天加含有RANKL和M?CSF培養(yǎng)基培養(yǎng)。所用完全培養(yǎng)基，是在MEM Alpha basic培養(yǎng)基中添加胎牛血清和雙抗制成的。其特征在于培養(yǎng)時間縮短，培養(yǎng)成本降低，使骨髓分離得到的可以分化為破骨細胞的單核細胞(破骨細胞前體細胞)純度更大，培養(yǎng)得到的破骨細胞有相當甚至更好的效果，且破骨細胞在酶活性和數(shù)目來看具有更寬的范圍，為篩選藥物提供了一個更為精細、快速、便捷的培養(yǎng)方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種骨髓來源的破骨細胞培養(yǎng)方法，屬于細胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

破骨細胞(Osteoclast，OC)是骨吸收的主要功能細胞，在骨發(fā)育、生長、修復(fù)、重建中具有重要的作用。破骨細胞起源于血系單核－巨噬細胞系統(tǒng)，是一種特殊的終末分化細胞，它可由其單核前體細胞通過多種方式融合形成巨大的多核細胞。破骨細胞是骨疾病研究領(lǐng)域的主要對象。破骨細胞的提取培養(yǎng)是骨疾病研究領(lǐng)域中最常用到的主要實驗技術(shù)手段之一，如何能高效快捷地得到破骨細胞是進行研究的首要任務(wù)。

傳統(tǒng)的破骨細胞培養(yǎng)方法為第一天取2只5周齡的ICR小鼠股骨和脛骨，用1mL無菌注射器吸取適量的無血清α-MEM培養(yǎng)液沖洗出內(nèi)腔中的骨髓,直至骨髓腔發(fā)白。反復(fù)吹打成細胞懸液，以100μm細胞篩網(wǎng)過濾至10mL離心管。1200r/min離心5min。棄上清，加入5mL紅細胞裂解液，輕輕吹打混勻，在冰上裂解5min，1000r/min離心5min。棄上清，加入5mL含10％FBS的培養(yǎng)基，混勻細胞，1000r/min離心5min。棄上清后加入適量含10％FBS的培養(yǎng)基重懸細胞，吹打均勻并接種于75cm²的培養(yǎng)瓶中，于37℃、體積分數(shù)5％CO₂培育箱中靜置培養(yǎng)過夜。第二天收集細胞上清液，置于10mL的離心管中，1200r/min離心5min，棄去上清，加入5mL10％FBS吹打均勻計數(shù)，向細胞懸液中加入巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)使其終濃度為30ng/mL，將細胞懸液吹打均勻，細胞密度1.8×10⁵/cm²種于96孔板中，每孔100μL。第三天吸棄上清去除不貼壁細胞，加入含30ng/mL M-CSF的10％的FBS 200μL。第五天吸棄上清，換液，加入含100ng/mL RANKL+50ng/mL M-CSF的10％FBS 200μL。第七天和第九天吸棄上清，換液，加入含100ng/mL RANKL+50ng/mL M-CSF的10％FBS 200μL。第十一天結(jié)束實驗。

上述技術(shù)方案，具有明顯不可逾越的缺點：耗時長：需要十一天才能達到效果；效率低：當前的步驟繁瑣，消耗精力；使用的誘導(dǎo)因子多，消耗經(jīng)費；得到的破骨細胞的單核細胞(破骨細胞前體細胞)純度不高。

因此，研發(fā)一種高效的細胞培養(yǎng)方法，縮短培養(yǎng)時間，降低培養(yǎng)成本，增強實驗效果，具有廣闊的應(yīng)用前景和巨大的市場價值。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足及實際的需求，本發(fā)明提供一種培養(yǎng)破骨細胞的方法，所述方法創(chuàng)造性地將細胞培養(yǎng)實驗時常縮短到五天，有效使破骨細胞純度更大，從特征形態(tài)、標志mRNA表達、骨吸收功能方面均有相當甚至更好的效果。具有廣闊的應(yīng)用前景和巨大的市場價值，為細胞培養(yǎng)提供了新的思路和方法。

為達此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種骨髓來源的破骨細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，將已提取的骨髓用分離液處理后獲得單核細胞，清洗后將所得的單核細胞加完全培養(yǎng)基和巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)，接種于96孔板中，于第二天加含有RANKL和M-CSF培養(yǎng)基培養(yǎng)。

所用完全培養(yǎng)基，是在無血清MEM Alpha basic培養(yǎng)基中添加胎牛血清FBS和分離液雙抗溶液制成的。