[發明專利]一種骨髓來源的破骨細胞培養方法

在審

• 申請號: 201910257672.3
• 申請日: 2019-04-01
• 公開（公告）號: CN109810941A
• 公開（公告）日: 2019-05-28
• 發明（設計）人: 李偉東;陸金蘭;謝輝;吳麗;夏晨潔;周雅倩
• 申請（專利權）人: 南京中醫藥大學
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077;A61K35/32;A61P19/10
• 代理公司: 北京精金石知識產權代理有限公司 11470
• 代理人: 強紅剛

1.一種骨髓來源的破骨細胞培養方法，其特征在于，將已提取的骨髓用分離液處理后獲得單核細胞，清洗后將所得的單核細胞加完全培養基和巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)，接種于96孔板中，于第二天加含有RANKL和M-CSF培養基培養，

所用完全培養基，是在MEM Alpha basic培養基中添加15％胎牛血清FBS和1％分離液雙抗溶液制成的。

2.權利要求1所述骨髓來源的破骨細胞培養方法，其特征在于，包括如下步驟,

1)在無菌條件下提取小鼠股骨后，利用勻漿沖洗液沖洗出骨髓腔中的骨髓，獲得骨髓原液；離心，棄上清，樣本稀釋液重懸細胞，備用；

2)于5mL玻璃采血管依次小心加入分離液1、分離液2和步驟1)所得細胞懸液，離心；此時離心管中由上至下分為六層，得到第二層為骨髓單核細胞；

3)吸取步驟2)中第二層到10mL離心管中，加入5mL洗滌液，混勻細胞，離心，棄上清；

4)加入5mL清洗液重懸步驟3)所得細胞，離心，棄上清后加入適量含15％FBS的完全培養基重懸細胞，計數，向細胞懸液中加入M-CSF，將細胞懸液吹打均勻，種于96孔板中，每孔100μL，進行37℃恒溫培養；

5)第二天棄上清，換液，加入含100ng/mL RANKL+50ng/mL M-CSF的15％FBS 280μL。置于37℃恒溫培養，于第5天培養完全，結束實驗。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟1)離心轉速為450g，優選地，離心時間為10min。

4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟2)所述分離液1與分離液2體積比為3:1，優選地步驟2)先后加入分離液1：4mL、分離液2：1.33mL，制成梯度界面，每加一層，液面分層一定要清晰；

優選地步驟2)離心需使用水平轉子離心機。離心轉速為500g，離心時間為30min。

5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟2)所述六層分別為第一層稀釋液層；第二層由稀釋液下層白環到分離液2上層50％為環狀乳白色單核細胞層；第三層由分離液2下層50％到分離液2下層白環為環狀乳白色單個核細胞層；第四層為透明分離液1液層；第五層為粒細胞層；第六層為紅細胞層。

6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟3)所述離心轉速為400g，優選地離心時間為10min。

7.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟4)所述離心轉速為250g，優選地離心時間為10min；

優選地使M-CSF終濃度為30ng/mL，96孔板中細胞密度為1.8×10⁵/cm²。