[發明專利]一種在大腸桿菌中進行木聚糖酶分泌表達的新方法

在審

• 申請號: 201910257530.7
• 申請日: 2019-04-01
• 公開（公告）號: CN109825488A
• 公開（公告）日: 2019-05-31
• 發明（設計）人: 易犁;張發英;何華華;喻嬋
• 申請（專利權）人: 湖北大學
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12N15/56;C12N15/70;C12N15/66
• 代理公司: 北京金智普華知識產權代理有限公司 11401
• 代理人: 楊采良

1.一種在大腸桿菌中進行木聚糖酶分泌表達的新方法，其特征在于，所述在大腸桿菌中進行木聚糖酶分泌表達的新方法包括：

第一步，獲取所需木聚糖酶基因，從多種信號肽的氨基酸序列SEQ ID NO：1～SEQ IDNO：7合成得到不同的信號肽的核苷酸序列SEQ ID NO：7～SEQ ID NO：14；

第二步，通過融合PCR的方式將信號肽融合于木聚糖酶基因的N末端，同時木聚糖酶基因序列的C端添加編碼組氨酸標簽的密碼子，PCR產物回收得到核苷酸序列Signalpeptide-Xylnase-6×His；

第三步，將第二步的核苷酸序列Signal peptide-Xylnase-6×His克隆到大腸桿菌表達載體pET28a中,測序確認得到正確的重組表達載體；

第四步，將重組表達載體轉化至大腸桿菌BL21菌株；

第五步，分別挑取轉化成功的單克隆表達菌株接種于2ml LB培養基中過夜培養，12-14h；

第六步，分別將過夜培養的菌液接種于含有50ml LB培養基的培養瓶中，培養；

第七步，向樣品中添加終濃度為0.5mM的IPTG誘導培養；實現木聚糖酶的高效分泌表達；

第八步，誘導完成的樣品，離心，收集上清得到分泌在培養基中的木聚糖酶樣品。

2.如權利要求1所述的在大腸桿菌中進行木聚糖酶分泌表達的新方法，其特征在于，第二步中，融合PCR為通過20bp的同源臂將片段A和片段B連接形成一個AB片段的酶鏈式聚合反應；

第四步中，轉化為將DNA導入有機體使得該DNA作為染色體外的元件復制。

3.如權利要求1所述的在大腸桿菌中進行木聚糖酶分泌表達的新方法，其特征在于，第六步中，將過夜培養的菌液以1:100的比列接種于含有50ml LB培養基的培養瓶中，37度培養至OD600＝0.6-0.8；

第七步中，向樣品中添加終濃度為0.5mM的IPTG，將樣品置于18℃誘導培養20h。

第八步中，誘導完成的樣品在17000rmp,4℃條件下離心10min，收集上清得到分泌在培養基中的木聚糖酶樣品。

4.如權利要求1所述的在大腸桿菌中進行木聚糖酶分泌表達的新方法，其特征在于，第八步中，收集得到的木聚糖酶粗酶液直接用于使用SDS-PAGE檢測，濃度和活性分析，同時直接使用鎳離子親和層析柱進行純化得到純蛋白。

5.如權利要求1所述的在大腸桿菌中進行木聚糖酶分泌表達的新方法，其特征在于，第三步中，堿性木聚糖酶XynHB大腸桿菌分泌表達載體的構建包括：

1)堿性木聚糖酶XynHB來源于枯草芽孢桿菌HBP8，并且去除自身N端的27個氨基酸信號肽的成熟形式；

2)通過在木聚糖酶成熟XynHB中N端融合可促進蛋白質進行胞外分泌的信號肽；

3)信號肽包括表征良好的來源于Sec途徑的信號肽OmpA、PelB、PhoA、Lpp,Tat途徑的信號肽TorA、Fdog,以及來源于Sec-Tat途徑的的信號肽FhuD；

4)根據大腸桿菌密碼子偏好表得到分別對應于各個信號肽的基因序列，同時在信號肽C末端添加和XynHB同源的20bp用于融合PCR；

5)片段Signal peptide-Xylnase-6×His的制備；

6)用NcoI和XhoI對載體pET28a和連接產物進行雙酶切，酶切反應于37℃下進行6h，切膠回收目的片段，用DNA純化試劑盒回收經NcoI和XhoI線性化的載體和目的片段；

7)根據各片段的回收情況確定連接體系，用T4DNA連接酶在16℃過夜連接；

8)將10ul的連接產物轉化到克隆宿主XL-Gold中，次日對單菌落進行菌落PCR驗證，正確的轉化子提質粒酶切，并測序驗證重組表達載體構建成功。