[發明專利]一種在大腸桿菌中進行木聚糖酶分泌表達的新方法

在審

• 申請號: 201910257530.7
• 申請日: 2019-04-01
• 公開（公告）號: CN109825488A
• 公開（公告）日: 2019-05-31
• 發明（設計）人: 易犁;張發英;何華華;喻嬋
• 申請（專利權）人: 湖北大學
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12N15/56;C12N15/70;C12N15/66
• 代理公司: 北京金智普華知識產權代理有限公司 11401
• 代理人: 楊采良

本發明屬于基因工程技術領域，公開了一種在大腸桿菌中進行木聚糖酶分泌表達的新方法，將信號肽融合于木聚糖酶基因的N末端，同時木聚糖酶基因序列的C端添加編碼組氨酸標簽的密碼子，PCR產物回收得到目的基因核苷酸序列Signal peptide?Xylnase?6×His，將目的基因克隆表達載體pET28a中，測序確認得到正確的重組表達載體；將重組表達載體轉化至大腸桿菌菌株；向樣品中添加IPTG，樣品誘導培養；實現木聚糖酶的高效分泌表達。本發明能夠將木聚糖酶直接分泌到培養基中；相比于原來的大腸桿菌胞內和或者酵母分泌表達，既能保證高的木聚糖酶活性，同時更容易操作，更省時，且成本更低。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域。尤其涉及一種在大腸桿菌中進行木聚糖酶分泌表達的新方法。

背景技術

目前，業內常用的現有技術是這樣的：

目前制備木聚糖酶的方法主要有兩類:一類大腸桿菌胞內表達，將目的基因克隆進大腸桿菌常用表達載體pET28a、pET26b中進行常規胞內表達，其需要復雜的細菌破碎和純化方法的步驟，同時無法避免由于物理作用對木聚糖酶的活性低純度低等問題，因此現有的研究成果均不建議在大腸桿菌中進行木聚糖酶的表達；另一類是畢赤酵母或釀酒酵母分泌表達，酵母細胞具有培養周期長，生長培養基復雜，生長環境十分嚴格等特點，一般的表達周期需要至少需要5天以上，此外畢赤酵母的生長pH一般需要嚴格控制在5.5-6.0左右，這將非常不利于堿性木聚糖酶在畢赤酵母中的表達。

木聚糖是植物半纖維素的主要成分，約占植物細胞干重的15％-30％，是除纖維素之外自然界中最為豐富的多聚糖，也是自然界中最為重要的可再生資源之一。木聚糖的降解利用需要豐富的木聚糖水解酶系中各種酶相互之間協同完成，而其中木聚糖酶是其中最關鍵的水解酶。同時，木聚糖酶因為其優異的水解多聚糖為低聚糖的特性，使其在造紙、生物能源、食品、飼料工業等行業中具有廣闊的應用前景。此外，工業中木聚糖酶大規模生物應用可以減少傳統化學處理方法造成的環境污染。

為了擴大木聚糖酶在工業中的應用，其中一個關鍵因素是開發一種低成本，省時，高產的生產方法。

由于大腸桿菌易于操作，快速生長和培養成本極低的特性，若是能解決胞內表達產量低，木聚糖酶的活性低純度低等問題，將會是理想的木聚糖酶異源表達宿主細胞。因而，開發木聚糖酶的分泌表達策略將有利于工業中木聚糖酶的大規模生物生產，其不需要細胞裂解步驟并避免了細胞裂解造成的復雜內源蛋白釋放和活性降低的影響。

綜上所述，現有技術存在的問題是：

(1)現有技術中，木聚糖酶的異源表達通過畢赤酵母或釀酒酵母分泌表達，大腸桿菌胞內表達。酵母細胞具有培養周期長，生長培養基復雜，生長環境十分嚴格等特點，表達周期需要至少需要5天以上，；對于大腸桿菌胞內表達，需要復雜的細菌破碎和純化方法的步驟，無法避免由于物理作用對木聚糖酶的活性低純度低等問題。

(2)木聚糖酶需要維持正確的蛋白結構以維持較高的酶活活性，同時對于堿性木聚糖酶而言需要更高的pH條件來保證高活性蛋白酶的表達，因此需要在簡單易操作的宿主中尋求更優化的表達條件。

(3)目前為止對于木聚糖酶生產還沒有大腸桿菌分泌表達的更多報道，大腸桿菌周質空間的大量分子伴侶可在分泌途徑中有效地協助分泌蛋白正確折疊，因而，因此對于建立一個新的表達系統，需要從其本身性質出發考慮選擇，設法發掘到有效的信號肽幫助其在大腸桿菌中的分泌。

解決上述技術問題的難度和意義：

木聚糖酶在醫藥、食品、造紙、動物飼養等工業中均應用廣泛，開發使用大腸桿菌等原核表達系統并進行大規模生產可以大幅度縮短實踐應用中的生產時間以及減少生產成本，進而提高工作效率。

發明內容

針對現有技術存在的問題，本發明提供了一種在大腸桿菌中進行木聚糖酶分泌表達的新方法。