[發明專利]鑒別動物源性成分的高分辨熔解方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201910257136.3
• 申請日: 2019-04-01
• 公開（公告）號: CN109868322B
• 公開（公告）日: 2023-05-02
• 發明（設計）人: 徐秦峰;賀曉玲;馬西亞
• 申請（專利權）人: 陜西科技大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 范巍

本發明公開了一種鑒別動物源性成分的高分辨熔解方法及試劑盒：提取樣品中的DNA作為模板，采用通用引物進行PCR擴增；對擴增產物采用高分辨熔解儀器進一步熔解；通過分析高分辨熔解曲線的形狀來鑒別樣品中的動物源性成分。本發明采用通用引物擴增目的基因序列，不僅可以準確鑒別樣品中的動物源性成分，而且相對于傳統的多重PCR，克服了引物對之間相互競爭、PCR反應條件優化難度大等問題，檢測效率顯著提高。本發明具有操作簡單、檢測快、檢測樣品通量高、檢測結果精準的優點，適用于乳制品以及其他食品中動物源性成分的摻假檢測及溯源鑒定。

技術領域

本發明屬于分子生物學鑒定技術領域，具體涉及一種用于乳制品等食品中動物源性成分鑒別的PCR高分辨熔解方法及試劑盒。

背景技術

乳制品是人類健康膳食的主要營養來源，在蛋白質、礦物質、脂肪、維生素等方面含量及種類豐富，深受消費者喜愛，隨著生活水平的提高，人們對乳制品的需求量不斷提升，乳制品市場成為了一個很大的銷售市場。在經濟利益的驅使下，商家使用各種手段盡可能地縮減成本，摻假售假的現象層出不窮。主要的摻假行為有：在乳制品生產過程中，以次充好，制假造假，如在羊乳中混入營養價值和價格相對較低的其他動物乳或非乳原料，這種情況下，乳制品的品質已經無法保證，存在損害消費者健康的風險。因此，鑒別乳制品中的動物源性成分確有必要。

目前應用于乳制品的摻假檢測方法，主要以乳制品中兩大生物分子的檢測為方向，一種是依據蛋白質分子在結構、性質之間的差異性所建立的方法，涉及色譜、質譜、免疫、電泳等。但是色譜和質譜價格昂貴，無法普及，而免疫法特異性較低，電泳法耗時長，并且以上檢測方法均因蛋白質受熱容易變性，對于經過均質、殺菌等熱處理的乳制品而言，檢測效果并不理想，所以實用價值不高。另外一種是基于DNA差異建立的檢測方法，盡管近年來專門提取DNA的試劑盒法應用的比較廣泛，但目前基于DNA檢測的方法也有一定的局限性。例如，瓊脂糖凝膠電泳中PCR擴增產物易受污染，且速度較慢；熒光定量PCR中，探針設計比較復雜且成本比較高。最新應用的檢測技術中，膜芯片法和液相芯片法都需要對PCR擴增產物進行雜交處理，存在污染的可能性，且無法判定摻假比例，只能確定某種動物源性成分的有無；基因條形碼技術Sanger測序法，需要進一步測序，步驟多且耗時長。即以上檢測方法存在耗時、不經濟、檢測結果不準確等問題。

高分辨熔解曲線分析(High?Resolution?Melting?analysis,HRM)是一種熒光PCR檢測技術，其主要原理是雙鏈的熔解行為取決于GC含量、DNA雙鏈的長度，以及堿基的互補性差異，通過在DNA熔解過程中實時檢測飽和熒光染料信號改變獲得熔解曲線，實現樣品差異的分析。這種分析方法，是一種閉管技術，由于使用了針對該方法所開發的飽和染料，出現非特異性擴增和抑制PCR擴增的可能性很少，結合采用的更加精密的分析儀器和軟件，數據收集和分析更加全面，將其用于乳制品中動物源性成分的鑒定，可以實現關系密切物種間的精準鑒別。

由于乳制品等食品中的動物源性成分所含線粒體DNA在經歷高溫、高壓或化學處理等加工過程后，性質依舊穩定，以及具有種屬特異性，所以更為適合用于分析動物源性成分的組成。但目前尚無利用通用引物進行高分辨熔解曲線分析并實現快速、經濟、準確分析和鑒別動物源性成分的方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種鑒別動物源性成分的高分辨熔解方法及試劑盒，本發明基于PCR高分辨熔解的方法，用以快速、經濟、準確地鑒別乳制品等食品中的動物源性成分。

為達到上述目的，本發明采用了以下技術方案：

一種鑒別動物源性成分的高分辨熔解方法，包括以下步驟：

1)根據樣品中的不同動物源性成分的可能摻入情況，確定需要鑒別的各動物源性成分所對應的動物種類，根據確定的動物種類，利用物種間在某段基因組DNA上的序列保守性和特異性選取或設計通用引物；

2)對通用引物進行擴增及擴增產物熔解的特異性檢驗；