[發(fā)明專利]鑒別動物源性成分的高分辨熔解方法及試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910257136.3
• 申請日: 2019-04-01
• 公開（公告）號: CN109868322B
• 公開（公告）日: 2023-05-02
• 發(fā)明（設計）人: 徐秦峰;賀曉玲;馬西亞
• 申請（專利權(quán)）人: 陜西科技大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 范巍

1.一種鑒別動物源性成分的高分辨熔解方法，其特征在于：包括以下步驟：

1）根據(jù)樣品中的不同動物源性成分的可能摻入情況，確定需要鑒別的各動物源性成分所對應的動物種類，根據(jù)確定的動物種類，利用物種間在某段基因組DNA上的序列保守性和特異性選取或設計通用引物；

2）對通用引物進行擴增及擴增產(chǎn)物熔解的特異性檢驗；所述通用引物為：

上游引物：5’-TTTGGTCCCAGCCTTCCTGTT-3’

下游引物：5’-CTTAGTCAAACTTTCGTTT-3’；

3）以提取自所述樣品中的DNA為模板，利用經(jīng)過檢驗確定的通用引物進行PCR擴增，對擴增得到的產(chǎn)物進行高分辨熔解并獲取高分辨熔解曲線，根據(jù)高分辨熔解曲線的位置、形狀、差異化圖的特征中的任意一種或多種鑒別樣品中的動物源性成分的構(gòu)成情況；

所述步驟3）中，將樣品對應的高分辨熔解曲線與對照品對應的高分辨熔解曲線進行二維或三維主成分分析，根據(jù)分析結(jié)果確定樣品與不同對照品所對應的高分辨熔解曲線的區(qū)分度，依據(jù)區(qū)分度確定樣品中動物源性成分的構(gòu)成，所述對照品選自不同動物源性成分各自的基因組DNA或相應不同基因組DNA的任意組合；

經(jīng)過步驟3）后，對于確定含有兩種動物源性成分的樣品，對該樣品對應的高分辨熔解曲線進行二維主成分分析，然后根據(jù)主成分-混合比例標準回歸方程計算得到所述樣品中兩種動物源性成分的比例；兩種動物源性成分對應的動物種類為水牛和牛，或者，兩種動物源性成分對應的動物種類為山羊和牛；

所述標準回歸方程是通過將兩種動物源性成分各自對應的基因組DNA及兩種動物源性成分對應的基因組DNA不同比例的混合物分別作為模板進行PCR擴增及高分辨熔解，并將各擴增產(chǎn)物的高分辨熔解曲線經(jīng)二維主成分分析所得到的主成分1的數(shù)值與對應的動物源性成分混合比例進行線性回歸分析而得到的。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種鑒別動物源性成分的高分辨熔解方法，其特征在于：所述樣品采集自乳制品或生乳。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種鑒別動物源性成分的高分辨熔解方法，其特征在于：所述PCR擴增采用的反應體系包括DNA模板、通用引物、PCR反應試劑以及熒光染料。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種鑒別動物源性成分的高分辨熔解方法，其特征在于：所述高分辨熔解的程序為：將PCR擴增的產(chǎn)物在閉管條件下從65℃開始逐漸升溫到95℃，并收集熒光信號。

5.一種鑒別動物源性成分的高分辨熔解方法，其特征在于：包括以下步驟：對于含有確定的兩種動物源性成分的樣品，以提取自所述樣品中的DNA為模板，利用通用引物進行PCR擴增，對擴增得到的產(chǎn)物進行高分辨熔解并獲取高分辨熔解曲線，對該高分辨熔解曲線進行二維主成分分析，然后根據(jù)標準回歸方程計算得到所述樣品中兩種動物源性成分的比例；該標準回歸方程是通過將所述兩種動物源性成分各自對應的基因組DNA及所述兩種動物源性成分對應的基因組DNA不同比例的混合物分別作為模板進行PCR擴增及高分辨熔解，并將各擴增產(chǎn)物的高分辨熔解曲線經(jīng)二維主成分分析所得到的主成分1的數(shù)值與對應的動物源性成分混合比例進行線性回歸分析而得到的；

所述通用引物為：

上游引物：5’-TTTGGTCCCAGCCTTCCTGTT-3’

下游引物：5’-CTTAGTCAAACTTTCGTTT-3’；

兩種動物源性成分對應的動物種類為水牛和牛，或者，兩種動物源性成分對應的動物種類為山羊和牛。