[發(fā)明專(zhuān)利]唾液中幾種類(lèi)固醇激素的定性定量檢測(cè)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910256466.0
• 申請(qǐng)日: 2019-04-01
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109828073A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-05-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄔智剛;朱文漓;葉尚宇
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 成都益康譜科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): G01N30/88
• 分類(lèi)號(hào): G01N30/88;G01N30/89
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種人體唾液中幾種類(lèi)固醇激素的檢測(cè)方法，其特征在于，所述檢測(cè)方法包括如下步驟：

1)將人體唾液樣本冷凍處理后經(jīng)蛋白沉淀，超聲提取并過(guò)濾，隨后與內(nèi)標(biāo)液混合，反相SPE柱純化和目標(biāo)產(chǎn)物的化學(xué)衍生得到待測(cè)樣本；

2)將上述待測(cè)樣本通過(guò)液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)，同步對(duì)幾種激素進(jìn)行定性和定量的批量檢測(cè)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述步驟中樣本冷凍時(shí)間為>24小時(shí)、溫度為-20℃。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述步驟中蛋白沉淀所用的有機(jī)溶劑包括甲醇、乙腈或丙酮，優(yōu)選的有機(jī)溶劑為甲醇，溫度為4℃，時(shí)間為>10分鐘。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，所述步驟中反相SPE的洗脫溶劑為甲醇或丙酮。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，所述步驟中化學(xué)衍生的試劑為乙酰肼三甲基氯化銨或吡啶酰氯、羥胺、甲基羥胺、鄰羥基胺等肟化衍生試劑中的一種；所述的化學(xué)衍生法反應(yīng)時(shí)間為5-30分鐘，反應(yīng)溫度為50-70℃。

6.根據(jù)權(quán)利要求1-5項(xiàng)任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟具體包括以下步驟：步驟1)稱(chēng)取8種激素的標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解得到不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液；

步驟2)稱(chēng)取內(nèi)標(biāo)樣品定容為內(nèi)標(biāo)液，隨后加入步驟1)中的標(biāo)準(zhǔn)液，超純水定容后離心，取上清液作為待測(cè)標(biāo)準(zhǔn)液；

步驟3)將步驟2)中得到的待測(cè)標(biāo)準(zhǔn)液和權(quán)利要求1中得到的待測(cè)樣本通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)，經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算得到唾液中8種激素的種類(lèi)和含量。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟3)中液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)的液相色譜條件為：

色譜柱為鍵合相色譜柱，進(jìn)樣量為5-50μL，流動(dòng)相A為水，0.01％TFA，流動(dòng)相B為乙腈甲醇的混合溶液，0.01％TFA，乙腈與甲醇的質(zhì)量比為9-1:1-9；

流動(dòng)相的流速為0.1-2.0mL/min；流動(dòng)相的梯度(以體積百分比計(jì))：

0-1min,A:100-80％,B:0-20％；

1.1-4min,A:80-20％,B:20-80％；

4.1-5min,A:20-0％,B:80-100％；

5.1-6min,A:0-80％,B:100-20％；

6.1min,A:80-100％,B:20-0％。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述鍵合相色譜柱為C18或C8等鍵合相色譜柱，規(guī)格為50-100mm*1.8-3mm,1.8-3μm。

9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟3)中液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)的質(zhì)譜條件為：采用電噴霧(ESI)離子源，正離子MRM掃描方式，霧化氣流速為5-10L/min，氣簾氣流速為5-20L/min，離子源電壓為2000-4500V，離子源溫度為200-400℃。

10.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述包括人體唾液中8種類(lèi)固醇激素；

采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)的質(zhì)譜掃描模式，目標(biāo)物的離子對(duì)監(jiān)測(cè)如下：脫氫表雄酮(m/z402.4–343.2)；17-羥基孕酮(m/z444.5–385.3)、孕酮(m/z428.5–369.3)、雄烯二酮(m/z440.4—381.2)、睪酮(m/z402.4–343.2)、皮質(zhì)醇(m/z476.5–417.3)、皮質(zhì)酮(m/z474.5–415.3)、醛固酮(m/z474.5–415.3)。