[發明專利]高產克拉維酸的棒狀鏈霉菌菌株、其脅迫選育方法及其用途

在審

• 申請號: 201910253775.2
• 申請日: 2019-03-30
• 公開（公告）號: CN109913392A
• 公開（公告）日: 2019-06-21
• 發明（設計）人: 周汝德;董慶茹;李振森;吳桂蘋
• 申請（專利權）人: 山東睿智醫藥科技有限公司;山東潤澤制藥有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/36;C12P17/18;C12R1/465;C12R1/22
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 張貴賓

本發明公開了一種高產克拉維酸的棒狀鏈霉菌菌株、其脅迫選育方法及其用途，屬于生物技術領域。本發明公開了一株高產克拉維酸的棒狀鏈霉菌菌株，該菌株已保藏于中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCC No.：2019110，其保藏時間為：2019年2月25日。本發明通過在培養基中添加脅迫物（青霉素和克雷伯氏菌），并通過合適的脅迫物加入方式、加入時機、培養條件、菌株的分離培養過程等，培育出高產克拉維酸的棒狀鏈霉菌菌株B?77。由本發明方法得到的菌株遺傳穩定性好，該菌株產克拉維酸的能力顯著提升，克拉維酸產量大、效價高。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種高產克拉維酸的棒狀鏈霉菌菌株、其脅迫選育方法及其用途。

背景技術

克拉維酸(Clavulanic Acid，CA)從棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus)發酵液中分離純化得到的β-內酰胺酶抑制劑，其分子為一個稠合雙環β-內酰胺結構，它以氧原子取代了青霉素及頭孢菌素噻唑環中的硫原子，具有作為β-內酰胺酶抑制劑所必須的3R，5R立體化學結構?？死S酸本身的抗菌活性很弱，但它是強力、廣譜且不可逆的β-內酰胺酶抑制劑。不論在體外或體內都能同耐藥的革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，特別是同肺炎克雷伯氏菌、奇異變形菌和金黃色葡萄球菌所產生的β-內酰胺酶生成牢固不可逆的結合物，從而抑制耐藥性細菌對β-內酰胺類抗生素的分解作用，恢復青霉素類及頭孢菌素類抗生素對許多產生β-內酰胺酶的耐藥菌的抗菌活性。

關于菌種選育方法很多，諸如化學誘變、物理誘變和原生質體融合等，以及代謝控制選育、基因工程改造方法等。中國專利申請CN201710411496.5公開了一種高產曲酸米曲霉的選育方法，以微波和紫外復合誘變選育，篩選出曲酸高產菌株；左志晗等采用原生質體融合技術，將克拉維酸生產菌——棒狀鏈霉菌甘油耐受性突變株和舒巴坦鈉耐受性突變株進行了原生質體融合得到一株克拉維酸高產菌株；王艷萍等通過紫外線誘變育種，選育出2株克拉維酸高產菌株，并具有良好的遺傳穩定性；中國專利申請CN201610739207.X公開了一株鏈霉菌及用它制備硫化物氧化酶制劑的方法，利用紫外線與硫酸二乙酯復合誘變的方法進行菌種誘變而獲得的硫化物氧化酶高產突變菌株。中國專利申請CN201410782691.5公開了一種脅迫條件下低蛋白酶A外泌酵母菌株及其構建方法，該方法通過敲除蛋白酶A編碼基因即PEP4基因的一個等位基因的同時過表達編碼液泡分選受體的MRL1基因來實現調節蛋白酶A胞內外分泌。

目前菌種誘變存在以下問題：

化學誘變、物理誘變和原生質體融合等高產菌株選育方法存在正負突變選育方向性不確定、選育周期長、選育效率低等問題。

代謝控制選育、菌種基因工程改造方法具有所需設備多、方法復雜、需知曉目標產物合成途徑或闡明產物合成基因功能序列等問題。

發明內容

為了解決現有技術正負突變選育方向性不明確、選育周期長、選育效率低、設備投入高等問題，彌補現有技術的不足，本發明提供了一種棒狀鏈霉菌高產菌株、其用途及其脅迫選育方法。

本發明的技術方案為：

一種高產克拉維酸的棒狀鏈霉菌菌株，該菌株已保藏于中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCC No.：2019110，其保藏時間為：2019年2月25日。

所述棒狀鏈霉菌菌株的脅迫選育方法，在棒狀鏈霉菌分離培養基中加入青霉素和克雷伯氏菌進行脅迫選育。

作為優選方案，所述棒狀鏈霉菌菌株的脅迫選育方法，包括步驟：

1）菌種活化

冷凍的棒狀鏈霉菌菌液解凍后，滴入棒狀鏈霉菌分離培養基斜面，劃線培養；25~30℃培養4~10天；

2）菌種冷凍保存