[發明專利]一種聚羥基脂肪酸酯的體外合成方法

有效

• 申請號: 201910248555.0
• 申請日: 2019-03-29
• 公開（公告）號: CN109913510B
• 公開（公告）日: 2021-04-13
• 發明（設計）人: 韓雪容;徐飛宏
• 申請（專利權）人: 長春理工大學
• 主分類號: C12P7/62
• 分類號: C12P7/62
• 代理公司: 哈爾濱市文洋專利代理事務所(普通合伙) 23210
• 代理人: 解瑩明

本發明涉及一種聚羥基脂肪酸酯體外合成方法，該方法以(R)?3?羥基丁酸(3HB)與(R)?2?羥基丁酸(2HB)為底物，將設計的底物聚合途徑中相關的底物前體合成酶乙酰輔酶A合成酶(ACS)、脂肪酸輔酶A轉移酶(PCT)和底物前體聚合酶PHA合酶(ReC)加入水相合成體系中混合，于28?31℃下靜置反應60?84h合成共聚酯P(3HB?co?2HB)。該方法利用基因體外重合表達獲得的PHA合成相關酶作為催化劑，可以將不能被微生物所利用或對微生物有毒性的物質作為底物，開發出具有新的材料性質的環境友好型生物材料。基于該合成方法底物比例可調、反應過程可視化的優勢，可實現合成共聚酯的任一組分含量的可調控性以及整個反應過程的智能檢測。

技術領域

本發明涉及聚羥基脂肪酸酯(PHA)合成領域，尤其涉及一種聚羥基脂肪酸共聚酯的體外合成方法。

背景技術

聚羥基脂肪酸酯(PHA)是一種可由多種微生物產生的胞內聚酯類物質。主要是微生物在培養條件不平衡(如氮源充足或碳源不足)時在細胞內產生并作為能源儲備的一種物質。因PHA具有和石油基塑料相同的熱塑性的同時還具有石油塑料所沒有的生物可降解性，因此PHA是替代傳統石油基塑料的新型環境友好生物材料。

PHA根據其碳原子數不同分為兩種：短鏈(SCL)PHA，其單體由3-5個碳原子組成；中長鏈(MCL)PHA，其單體由6-14個碳原子組成。根據其單體的碳原子數及側鏈不同PHA又具有從彈性到脆性的廣泛材料性質。此外PHA還具有良好的生物相容性、氣體阻隔性、壓電性等，在生物醫用材料、包裝材料、電學材料等方面具有廣闊的應用前景。最簡單的PHA是以(R)-3-羥基丁酸(3HB)為結構單元的均聚物(PHB)。但是PHB結晶性高，脆性高，彈性差的性質導致其可加工范圍較小，不能滿足不同材料領域需求。

PHA的合成通常是利用微生物生長過程中的代謝途徑在微生物體內合成PHA(微生物發酵法)，該方法受限于微生物的代謝途徑，而不能以那些無法被微生物所利用的物質作為結構單元合成PHA。因此現在急需一種不受微生物代謝途經所限制的PHA的方法。

發明內容

本發明的目的是為了解決現有技術中PHA只能依賴微生物的代謝途徑發酵制備的問題，進而提供一種不依賴微生物的代謝途徑的體外合成方法。

本發明的技術方案是：一種體外合成聚羥基脂肪酸酯的方法，所述聚羥基脂肪酸酯是在微生物體外合成的。

進一步地，將自主設計的PHA合成途徑中的相關酶ACS合成酶、PCT合成酶以及ReC合成酶加入水相合成體系中與聚合底物溶液混合，于28-31℃下靜置反應60-84h合成PHA。

進一步地，所述水相合成體系中聚合底物為(R)-3-羥基丁酸((R)-3HB)與(R)-2-羥基丁酸((R)-2HB)。

進一步地，合成共聚酯中，(R)-2-羥基丁酸(R)-2-HB組分的摻入比例為0～33mol％。

進一步地，所述水相合成體系中，ACS合成酶濃度為0.2mg/mL、PCT合成酶濃度為0.2mg/mL、ReC合成酶濃度為0.5mg/mL。

進一步地，所述水相合成體系包括100mM磷酸二氫鈉、10mM氯化鎂、30mM ATP、0.2mg/ml小牛血清白蛋白、1mM CoA、10mM乙酸、200mM3-羥基丁酸與2-羥基丁酸的混合物。

進一步地，ACS合成酶的制備包括如下步驟：

將含有acs基因的重組載體pCold-acs通過熱轉化至大腸桿菌BL21(DE3)構建重組表達菌株，經誘導表達及純化后得到ACS合成酶。

進一步地，PCT合成酶的制備包括如下步驟：

將含有pct基因的重組載體pQE-pct通過熱轉化至大腸桿菌BL21(DE3)構建重組表達菌株，經誘導表達及純化后得到PCT合成酶。