[發明專利]檢測甲藻細胞凋亡的方法

有效

• 申請號: 201910246905.X
• 申請日: 2019-03-29
• 公開（公告）號: CN110018143B
• 公開（公告）日: 2022-04-05
• 發明（設計）人: 陳輝蓉;吳梓涵;黎雙飛;胡章立;陳秀銳;李城彥
• 申請（專利權）人: 深圳大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 深圳市恒申知識產權事務所(普通合伙) 44312
• 代理人: 袁文英

本發明公開了一種檢測甲藻細胞凋亡的方法。所述檢測甲藻細胞凋亡的方法包括步驟有：對甲藻細胞進行凋亡處理；對凋亡處理的甲藻細胞進行濃縮處理；對甲藻細胞濃縮液進行AnnexinV、PI染色處理；對染色甲藻細胞液進行成像流式檢測處理；依據AnnexinV/PI散點圖計算甲藻細胞的凋亡率。本發明檢測甲藻細胞凋亡的方法通過成像流式細胞儀能夠有效區分AnnexinV熒光、碘化丙啶熒光、葉綠素自發熒光，從而直接定量測出待測甲藻細胞中發生凋亡的甲藻細胞個數，從而得出細胞早期凋亡率，而且還具有定量可靠，分析準確，結果精度高等優點。

技術領域

本發明屬于細胞檢測技術領域，具體涉及一種檢測甲藻細胞凋亡的方法。

背景技術

赤潮是浮游生物大量爆發后引起水體改變顏色的一種有害生態現象，能夠引起赤潮發生的種類有300多種，例如赤潮有害甲藻塔瑪亞歷山大甲藻 (Alexandriumtamarense)它能夠釋放麻痹性貝毒(paralyticshell fish poisoning，PSP)，貝毒進入環境以后對海洋經濟和人類健康構成嚴重威脅。程序性死亡(Programmed cell death，PCD)是細胞在生長或受到環境脅迫時基因調控的自主有序死亡，為了有效控制赤潮，了解赤潮甲藻細胞凋亡有著顯著的意義。

目前應用較多的細胞凋亡檢測方法主要有細胞膜磷酰脂絲氨酸(PS)檢測，Caspase酶活性檢測，原位DNA標記檢測法，ROS檢測。其中，以細胞膜磷酰脂絲氨酸(PS)檢測方法為例，其原理是利用AnnexinV/PI雙染來檢測細胞凋亡。細胞在凋亡早期的時候，細胞膜內的磷酰脂絲氨酸(PS)會從細胞膜內轉移到細胞膜外，使其暴露在細胞膜外表面，而AnnexinV是鈣依賴性磷脂結合蛋白，它能與PS進行特異性結合，PI是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但對凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核染紅。因此采用AnnexinV/PI雙染的方法可以區分正常細胞、凋亡早期、凋亡晚期與壞死細胞。

流式細胞儀主要應用于醫學研究中如細胞活力、細胞鑒定。細胞凋亡和細胞信號轉導等方面，利用AnnexinV/PI雙染檢測細胞凋亡PS的方法應用廣泛。但這一方法應用于檢測甲藻類細胞凋亡的時候具有局限性，因為甲藻細胞具有自發熒光，普通流式細胞儀普遍不能區分甲藻細胞自發葉綠素 (Chla)紅色熒光與碘化丙啶(PI分子式為C₂₇H₃₄I₂N₄)發出的熒光，而且在使用的同時也無法直觀觀察到甲藻細胞的外觀特征，在分析樣品數據的時候難以區分處于不同特征界限的部分甲藻細胞群體，也無法精準定位單個細胞內的熒光信號，從而導致結果準確度不高，而且還存在技術要求高、樣品耗用量大的缺陷。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的所述不足，提供一種檢測甲藻細胞凋亡的方法，以解決現有普通流式細胞儀不能區分甲藻細胞自發Chla紅色熒光與PI發出的熒光，從而導致細胞凋亡檢測結果準確度不高的技術問題。

為了實現所述發明目的，本發明提供了一種檢測甲藻細胞凋亡的方法。所述檢測甲藻細胞凋亡的方法包括如下步驟：

將待檢測甲藻液采用細胞凋亡誘導劑進行細胞凋亡誘導處理；

對經所述細胞凋亡誘導處理處理的所述甲藻液進行離心懸浮處理，甲藻細胞濃縮液；

向所述甲藻細胞濃縮液中添加AnnexinV/FITC并進行孵育處理后，再繼續加入碘化丙啶進行染色處理，獲得染色甲藻細胞液；

將采用成像流式細胞儀對所述染色甲藻細胞液中的甲藻細胞特征進行分析，生成AnnexinV/PI散點圖，根據所述散點圖選取細胞群體，然后根據選取的所述細胞群體得出受測甲藻樣品中的甲藻細胞凋亡細胞個數，根據所述甲藻細胞凋亡細胞個數計算出甲藻細胞的凋亡率。