[發(fā)明專利]一種5-氨基乙酰丙酸高產(chǎn)重組菌株及其用途

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910246577.3
• 申請日: 2019-03-28
• 公開（公告）號: CN110004164B
• 公開（公告）日: 2023-01-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李維;葛方蘭;陳貴英;左勇;文冬梅;葛清蓉
• 申請（專利權(quán)）人: 四川師范大學(xué)
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N15/70;C12N1/21;C12P13/00;C12R1/19
• 代理公司: 成都高遠(yuǎn)知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽;張娟

本發(fā)明提供了一種重組質(zhì)粒，它能表達(dá)莢膜紅細(xì)菌的hemA基因，還能抑制大腸桿菌本身的hemB基因的表達(dá)。本發(fā)明還提供了一種重組菌，它是帶有前述重組質(zhì)粒的大腸桿菌。將本發(fā)明的重組質(zhì)?；蛑亟M菌用于5?氨基乙酰丙酸發(fā)酵，能夠顯著提高5?氨基乙酰丙酸的產(chǎn)量，且無需添加外源性5?氨基乙酰丙酸脫水酶抑制劑來阻礙5?氨基乙酰丙酸在菌內(nèi)的代謝。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物工程領(lǐng)域，尤其涉及一種5-氨基乙酰丙酸高產(chǎn)菌株及其制備方法。

背景技術(shù)

5-氨基乙酰丙酸(5-Aminolevulinic acid，ALA)，又名5-氨基酮戊酸，是一種非蛋白氨基酸，分子量為131.2。5-氨基乙酰丙酸廣泛存在于動植物和微生物細(xì)胞中，是生物體內(nèi)合成葉綠素、血紅素、卟啉和維生素B₁₂等四吡咯化合物的前體物質(zhì)。ALA作為光敏劑，在臨床醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中具有廣泛的用途。在醫(yī)學(xué)上，ALA可用于癌癥的光動力學(xué)治療和診斷。在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，由于5-氨基乙酰丙酸具有易降解、無殘留和對人畜無毒性的優(yōu)點，可作為新型綠色殺蟲劑、除草劑及生長調(diào)節(jié)因子而受到行業(yè)的高度重視。

在早期，ALA的生產(chǎn)只能通過化學(xué)方法合成，但化學(xué)合成存在工藝復(fù)雜、產(chǎn)率低、毒副產(chǎn)品多且污染環(huán)境等問題。所以近年來生物法合成ALA備受關(guān)注。在自然界中，生物體合成ALA的代謝途徑主要有C4和C5兩種途徑。C4途徑合成ALA主要存在于動物、真菌和非硫光合細(xì)菌中，是由琥珀酰-CoA和甘氨酸在5-氨基乙酰丙酸合成酶(ALAS，由hemA編碼)的作用下縮合生成ALA。在C5途徑中，首先谷氨酸在谷氨酰-tRNA合成酶(GluRS，由gltX編碼)的催化下生成谷氨酰-tRNA，然后谷氨酰-tRNA在谷氨酰-tRNA還原酶(GluTR，由hemA編碼)的催化下生成谷氨醛，最后谷氨醛在谷氨醛氨基轉(zhuǎn)移酶(GSA-AT，由hemL編碼)催化作用下生成ALA。

隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，生物法合成ALA因生產(chǎn)過程簡單、成本低、產(chǎn)量高和環(huán)境友好等優(yōu)點倍受人們的關(guān)注。在自然界中，許多生物能合成ALA，如光合細(xì)菌就是一類能合成ALA并將其分泌到細(xì)胞外的微生物。在自然界中篩選得到的野生型菌株，ALA產(chǎn)物積累量太低，達(dá)不到工業(yè)生產(chǎn)的需求。目前，提高微生物產(chǎn)ALA的方法主要有兩類：一類是利用誘變育種的方法，選育出能高產(chǎn)ALA的菌株，在特定的培養(yǎng)基中發(fā)酵累積ALA。另一類是通過代謝工程技術(shù)改造微生物合成ALA的C4或C5代謝途徑，強(qiáng)化關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，并抑制ALA代謝途徑中下游酶(5-氨基乙酰丙酸脫水酶)的表達(dá)，從而提高ALA的產(chǎn)量。

5-氨基乙酰丙酸脫水酶(5-aminolevulinate dehydratase，ALAD)又名膽色素原合成酶(porphobilinogen synthase，PBGS)，由hemB基因編碼，能催化兩分子ALA不對稱縮合成一分子膽色素原(porphobilinogen，PBG)，膽色素原是生物體內(nèi)各種四吡咯化合物的前體物質(zhì)。ALAD作為ALA代謝途徑中的下游酶，能在工程菌發(fā)酵生產(chǎn)ALA的過程中，使ALA的積累量減少(圖1)，但缺乏此酶會影響細(xì)胞的正常生命活動。

在工程菌生產(chǎn)ALA過程中，為減少ALA的下游代謝，常常通過添加乙酰丙酸和D-葡萄糖等抑制劑降低ALAD的活性(Nishikawa等，Journal of Bioscience＆Bioengineering，1999，87(6)：798.Liu等，Applied Biochemistry＆Biotechnology，2010，160(3)：822-830.)來提高發(fā)酵液中ALA的積累量。通過添加抑制劑降低ALAD的活性，使得生產(chǎn)ALA的發(fā)酵工藝變得復(fù)雜，而且不利于后期對ALA的分離提純，且增加了生產(chǎn)成本。