[發明專利]重組單純皰疹病毒及其制備方法和應用、重組載體的構建方法及其應用

在審

• 申請號: 201910246070.8
• 申請日: 2019-03-29
• 公開（公告）號: CN109868263A
• 公開（公告）日: 2019-06-11
• 發明（設計）人: 易吉輝;孫錦霞;袁文娟;許春蓮
• 申請（專利權）人: 深圳精準醫療科技有限公司
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/90;C12N15/85;C12N15/12;A61K35/763;A61K48/00;A61K38/17;A61P35/00;C12R1/93
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 林青中;潘艷麗

本發明涉及一種重組單純皰疹病毒及其制備方法和應用、重組載體的構建方法及其應用。該重組單純皰疹病毒，所述重組單純皰疹病毒缺失ICP34.5基因和ICP47基因，且缺失的所述ICP34.5基因的位點與缺失的所述ICP47基因的位點上均插入有可溶性PD?1片段。上述重組單純皰疹病毒的安全性較好。

技術領域

本發明涉及基因工程領域，特別是涉及一種重組單純皰疹病毒、重組載體及其制備方法和應用、重組載體的構建方法及其應用。

背景技術

程序性死亡受體1(PD-1)主要表達于活化的T細胞，它與相應受體PD-L1或PD-L2結合后傳遞負調控信號，導致T細胞的免疫應答關閉。多種腫瘤細胞均高表達PD-L1，這些腫瘤細胞通過其表達的PD-L1與T細胞表面的PD-1結合，誘導腫瘤特異性T細胞凋亡和免疫無能，最終導致腫瘤細胞逃脫T細胞的免疫監視和殺傷。

而溶瘤病毒是一類具有復制能力的腫瘤殺傷型病毒，能夠在腫瘤細胞中大量繁殖并殺死腫瘤細胞。其中，HSV-1，Ⅰ型單純皰疹病毒，是一種長約154kp的雙鏈DNA病毒，可在受染宿主細胞核中復制。HSV-1具有天然的溶瘤特性，被廣泛用于細胞生物學、免疫學領域以及腫瘤治療的創新疫苗和載體的開發。然而，傳統的HSV-1的毒性較強，不僅對腫瘤細胞具有殺傷作用，也能夠殺傷正常細胞，安全性較差。

發明內容

基于此，有必提供一種安全性較好的重組單純皰疹病毒。

此外，還提供一種重組單純皰疹病毒的制備方法和應用、重組載體的構建方法及其應用。

一種重組單純皰疹病毒，所述重組單純皰疹病毒缺失ICP34.5基因和ICP47基因，且在缺失的所述ICP34.5基因的位點與缺失的所述ICP47基因的位點上均插入有可溶性PD-1片段。

研究表明，單純皰疹病毒中的ICP34.5基因可以對抗PKR(雙鏈RNA依賴的蛋白質激酶)引起的應激信號通路因子eIF-2α的失活，使病毒得以正常繁殖，因此，缺失ICP34.5基因的重組單純皰疹病毒進入正常細胞后，能夠引起eIF-2α的失活，使得重組單純皰疹病毒不能繁殖而不會對正常細胞產生毒性，安全性較高；由于腫瘤細胞內的PKR處于失活狀態，缺失ICP34.5基因的重組單純皰疹病毒能夠在腫瘤細胞中正常繁殖，而具有較高的腫瘤靶向性。單純皰疹病毒中的ICP47基因可以阻礙MHCⅠ類分子介導的抗原遞呈，重組單純皰疹病毒中缺失ICP47基因，有利于增強免疫反應，提高重組單純皰疹病毒對腫瘤細胞的攻擊。同時，上述重組單純皰疹病毒通過在缺失的ICP34.5基因的位點與缺失的ICP47基因的位點上均插入可溶性PD-1片段，以能夠表達可溶性PD-1，以能夠競爭性地與腫瘤細胞表達的PD-L1結合，恢復腫瘤特異性T細胞的殺傷功能。經試驗驗證，上述重組單純皰疹病毒能夠殺傷腫瘤細胞，對正常細胞沒有殺傷作用，且能夠高效表達能夠與PD-L1結合的可溶性PD-1，以提高腫瘤特異性T細胞的殺傷功能。

其中一個實施例中，所述可溶性PD-1片段的序列如SEQ ID No.1所示。

其中一個實施例中，所述重組單純皰疹病毒的保藏號為CCTCC NO：V201863。

一種重組載體的構建方法，包括如下步驟：

以p galk載體為模板，采用第一同源臂引物對進行PCR擴增，得到ΔICP34.5-galk片段；將所述ΔICP34.5-galk片段轉入感受態的第一重組菌中，進行galk正篩選，得到第二重組菌，所述ΔICP34.5-galk片段含有依次連接的ICP34.5基因上游側翼區序列、galk表達盒及ICP34.5基因下游側翼區序列，所述第一重組菌中含有攜帶HSV-1病毒基因組的載體，所述第二重組菌缺失ICP34.5基因，且缺失的所述ICP34.5基因的位點上插入有所述ΔICP34.5-galk片段；