[發明專利]重組單純皰疹病毒及其制備方法和應用、重組載體的構建方法及其應用

在審

• 申請號: 201910246070.8
• 申請日: 2019-03-29
• 公開（公告）號: CN109868263A
• 公開（公告）日: 2019-06-11
• 發明（設計）人: 易吉輝;孫錦霞;袁文娟;許春蓮
• 申請（專利權）人: 深圳精準醫療科技有限公司
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/90;C12N15/85;C12N15/12;A61K35/763;A61K48/00;A61K38/17;A61P35/00;C12R1/93
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 林青中;潘艷麗

1.一種重組單純皰疹病毒，其特征在于，所述重組單純皰疹病毒缺失ICP34.5基因和ICP47基因，且在缺失的所述ICP34.5基因的位點與缺失的所述ICP47基因的位點上均插入有可溶性PD-1片段。

2.根據權利要求1所述的重組單純皰疹病毒，其特征在于，所述可溶性PD-1片段的序列如SEQ ID No.1所示。

3.根據權利要求1所述的重組單純皰疹病毒，其特征在于，所述重組單純皰疹病毒的保藏號為CCTCC NO：V201863。

4.一種重組載體的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

以p galk載體為模板，采用第一同源臂引物對進行PCR擴增，得到ΔICP34.5-galk片段；將所述ΔICP34.5-galk片段轉入感受態的第一重組菌中，進行galk正篩選，得到第二重組菌，所述ΔICP34.5-galk片段含有依次連接的ICP34.5基因上游側翼區序列、galk表達盒及ICP34.5基因下游側翼區序列，所述第一重組菌中含有攜帶HSV-1病毒基因組的載體，所述第二重組菌缺失ICP34.5基因，且缺失的所述ICP34.5基因的位點上插入有所述ΔICP34.5-galk片段；

以含有可溶性PD-1表達盒的載體為模板，采用第二同源臂引物對進行PCR擴增，得到ΔICP34.5-hsPD-1片段，將所述ΔICP34.5-hsPD-1片段轉入感受態的所述第二重組菌中，進行galk負篩選，得到第三重組菌，所述ΔICP34.5-hsPD-1片段含有依次連接的所述ICP34.5基因上游側翼區序列、所述可溶性PD-1表達盒及所述ICP34.5基因下游側翼區序列，所述第三重組菌缺失所述ΔICP34.5-galk片段，且缺失的所述ΔICP34.5-galk片段的位點上插入有所述ΔICP34.5-hsPD-1片段；

以所述p galk載體為模板，采用第三同源臂引物對進行PCR擴增，得到ΔICP47-galk片段，將所述ΔICP47-galk片段轉入感受態的所述第三重組菌中，進行galk正篩選，得到第四重組菌，所述ΔICP47-galk片段含有依次連接的ICP47上游側翼區序列、所述galk表達盒及ICP47基因下游側翼區序列，所述第四重組菌缺失ICP47基因，且缺失的所述ICP47基因的位點上插入有所述ΔICP47-galk片段；及

以所述含有可溶性PD-1表達盒的載體為模板，采用第四同源臂引物對進行PCR擴增，得到ΔICP47-hsPD-1片段，將所述ΔICP47-hsPD-1片段轉入感受態的所述第四重組菌中，進行galk負篩選，得到重組載體，所述ΔICP47-hsPD-1片段含有依次連接的所述ICP47基因上游側翼區序列、所述可溶性PD-1表達盒及所述ICP47基因下游側翼區序列，所述重組載體缺失所述ΔICP47-galk片段，且缺失的所述ΔICP47-galk片段的位點上插入有所述ΔICP47-hsPD-1片段。

5.根據權利要求4所述的重組載體的構建方法，其特征在于，所述可溶性PD-1表達盒含有可溶性PD-1片段，所述可溶性PD-1片段的序列如SEQ ID No.1所示；

及/或，所述第一重組菌的保藏號為CCTCC NO：M2018944。