[發(fā)明專利]重組單純皰疹病毒及其制備方法和應(yīng)用、重組載體的構(gòu)建方法及其應(yīng)用在審
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201910246070.8 | 申請(qǐng)日： | 2019-03-29 |
| 公開（公告）號(hào)： | CN109868263A | 公開（公告）日： | 2019-06-11 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 易吉輝;孫錦霞;袁文娟;許春蓮 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 深圳精準(zhǔn)醫(yī)療科技有限公司 |
| 主分類號(hào)： | C12N7/01 | 分類號(hào)： | C12N7/01;C12N15/90;C12N15/85;C12N15/12;A61K35/763;A61K48/00;A61K38/17;A61P35/00;C12R1/93 |
| 代理公司： | 廣州華進(jìn)聯(lián)合專利商標(biāo)代理有限公司 44224 | 代理人： | 林青中;潘艷麗 |
| 地址： | 518051 廣東省深圳市南山區(qū)科園*** | 國(guó)省代碼： | 廣東;44 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說(shuō)明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 重組單純皰疹病毒 制備方法和應(yīng)用 重組載體 構(gòu)建 位點(diǎn) 應(yīng)用 | ||
1.一種重組單純皰疹病毒，其特征在于，所述重組單純皰疹病毒缺失ICP34.5基因和ICP47基因，且在缺失的所述ICP34.5基因的位點(diǎn)與缺失的所述ICP47基因的位點(diǎn)上均插入有可溶性PD-1片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組單純皰疹病毒，其特征在于，所述可溶性PD-1片段的序列如SEQ ID No.1所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組單純皰疹病毒，其特征在于，所述重組單純皰疹病毒的保藏號(hào)為CCTCC NO：V201863。
4.一種重組載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：
以p galk載體為模板，采用第一同源臂引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到ΔICP34.5-galk片段；將所述ΔICP34.5-galk片段轉(zhuǎn)入感受態(tài)的第一重組菌中，進(jìn)行g(shù)alk正篩選，得到第二重組菌，所述ΔICP34.5-galk片段含有依次連接的ICP34.5基因上游側(cè)翼區(qū)序列、galk表達(dá)盒及ICP34.5基因下游側(cè)翼區(qū)序列，所述第一重組菌中含有攜帶HSV-1病毒基因組的載體，所述第二重組菌缺失ICP34.5基因，且缺失的所述ICP34.5基因的位點(diǎn)上插入有所述ΔICP34.5-galk片段；
以含有可溶性PD-1表達(dá)盒的載體為模板，采用第二同源臂引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到ΔICP34.5-hsPD-1片段，將所述ΔICP34.5-hsPD-1片段轉(zhuǎn)入感受態(tài)的所述第二重組菌中，進(jìn)行g(shù)alk負(fù)篩選，得到第三重組菌，所述ΔICP34.5-hsPD-1片段含有依次連接的所述ICP34.5基因上游側(cè)翼區(qū)序列、所述可溶性PD-1表達(dá)盒及所述ICP34.5基因下游側(cè)翼區(qū)序列，所述第三重組菌缺失所述ΔICP34.5-galk片段，且缺失的所述ΔICP34.5-galk片段的位點(diǎn)上插入有所述ΔICP34.5-hsPD-1片段；
以所述p galk載體為模板，采用第三同源臂引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到ΔICP47-galk片段，將所述ΔICP47-galk片段轉(zhuǎn)入感受態(tài)的所述第三重組菌中，進(jìn)行g(shù)alk正篩選，得到第四重組菌，所述ΔICP47-galk片段含有依次連接的ICP47上游側(cè)翼區(qū)序列、所述galk表達(dá)盒及ICP47基因下游側(cè)翼區(qū)序列，所述第四重組菌缺失ICP47基因，且缺失的所述ICP47基因的位點(diǎn)上插入有所述ΔICP47-galk片段；及
以所述含有可溶性PD-1表達(dá)盒的載體為模板，采用第四同源臂引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到ΔICP47-hsPD-1片段，將所述ΔICP47-hsPD-1片段轉(zhuǎn)入感受態(tài)的所述第四重組菌中，進(jìn)行g(shù)alk負(fù)篩選，得到重組載體，所述ΔICP47-hsPD-1片段含有依次連接的所述ICP47基因上游側(cè)翼區(qū)序列、所述可溶性PD-1表達(dá)盒及所述ICP47基因下游側(cè)翼區(qū)序列，所述重組載體缺失所述ΔICP47-galk片段，且缺失的所述ΔICP47-galk片段的位點(diǎn)上插入有所述ΔICP47-hsPD-1片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述可溶性PD-1表達(dá)盒含有可溶性PD-1片段，所述可溶性PD-1片段的序列如SEQ ID No.1所示；
及/或，所述第一重組菌的保藏號(hào)為CCTCC NO：M2018944。
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