[發(fā)明專利]一種提高角蛋白酶活力的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910246031.8
• 申請日: 2019-03-28
• 公開（公告）號: CN109797145A
• 公開（公告）日: 2019-05-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王天文;梁辰;安亞菲;肖颯;徐紅菊
• 申請（專利權(quán)）人: 信陽師范學(xué)院
• 主分類號: C12N9/54
• 分類號: C12N9/54;A23K10/14;C05F17/00;C05G3/04;C12R1/085
• 代理公司: 南京業(yè)騰知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 32321
• 代理人: 鄭婷

1.一種提高角蛋白酶活力的方法，其特征在于，通過添加錳離子以提高角蛋白酶的活力。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，除了可以被常規(guī)蛋白酶作用的蛋白底物外，該酶還可以分解家禽廢棄羽毛等難以降解的角質(zhì)蛋白。

3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述添加錳離子是指在Bacillus cereusFDB-18B菌株的培養(yǎng)基中添加錳離子，以提高其所產(chǎn)角蛋白酶的活力，具體步驟如下：

(1)取Bacillus cereus FDB-18B菌株甘油保藏菌液，劃線接種于LB固體培養(yǎng)基上，然后在37℃下培養(yǎng)24h，LB固體培養(yǎng)基上有菌落生成；

(2)挑取菌落接種于裝有10ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃、150rpm下培養(yǎng)16h，得到菌液；

(3)取1ml菌液接種于50ml LB液體培養(yǎng)基中，往培養(yǎng)基中加入錳離子至濃度為0.1-2mM，然后在37℃、150rpm下培養(yǎng)32h，得到菌液；

(4)將步驟(3)得到的菌液進行離心取上清液，用標準方法以酪蛋白為底物，測定660nm吸光度并計算蛋白酶活力。

4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述添加錳離子是指在羽毛發(fā)酵培養(yǎng)基中加入錳離子，以提高角蛋白酶對羽毛的分解能力，具體步驟如下：

(1)取Bacillus cereus FDB-18B菌株甘油保藏菌液，劃線接種于LB固體培養(yǎng)基上，然后在37℃下培養(yǎng)24h，LB固體培養(yǎng)基上有菌落生成；

(2)挑取菌落接種于裝有10ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃、150rpm下培養(yǎng)16h，得到菌液；

(3)取1ml菌液接種于40ml羽毛發(fā)酵培養(yǎng)基中，同時往培養(yǎng)基中加入錳離子至濃度為0.1-2mM，然后在37℃、150rpm下培養(yǎng)24h；

(4)將培養(yǎng)后降解殘余的羽毛撈出漂洗烘干，稱剩余羽毛干重，根據(jù)計算羽毛分解率的公式：111.8％*(1-W殘留/W初始)，計算羽毛降解率。

5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述添加錳離子是指在測定角蛋白酶活力時加入錳離子，以提高角蛋白酶的活力，具體包括如下步驟：

1)取三支1.5ml離心管，加入0.65％酪蛋白溶液500μl，10Mm NaOOCCH3-5mMCa(OOCCH3)2緩沖溶液50μl，超純水33μl，0.1M錳離子溶液12μl；

2)一支上述離心管作為CK，加入0.11M三氯乙酸溶液500μl，再加入5μl凍存的角蛋白酶，搖勻備用；

3)兩支上述離心管作為實驗組，放在50℃的金屬干浴器上預(yù)熱5min，而后加入5μl凍存的角蛋白酶，搖勻放回干浴器反應(yīng)10min，然后立即加入0.11M三氯乙酸溶液500μl搖勻；

4)將三支離心管放入30℃環(huán)境中反應(yīng)30min，結(jié)束后12000g離心5min分離蛋白沉淀；

5)取200μl上述離心上清液于新的1.5ml離心管，加入0.5M Na2CO3溶液500μl，0.5M福林酚100μl，搖勻后放入30℃環(huán)境中反應(yīng)30min；

6)12000g離心5min，CK作校零對照，取上清液測實驗組OD660值；

7)將測得的OD660值與標準曲線比較，得到實際酶活力。

6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述錳離子是MnSO₄、MnCl₂或Mn(NO₃)₂溶液。

7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所用的錳離子濃度為0.1-5mM；作為優(yōu)選方案，其濃度為測活體系中2mM，培養(yǎng)體系中0.2mM。