[發明專利]一種表達羧肽酶G2的基因工程菌及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201910245430.2
• 申請日: 2019-03-28
• 公開（公告）號: CN111748505B
• 公開（公告）日: 2022-12-30
• 發明（設計）人: 胡又佳;謝麗萍;阮江雄;韓姝;徐磊;龔桂花;張偉;沈鴻月
• 申請（專利權）人: 上海醫藥工業研究院;中國醫藥工業研究總院
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N9/48;C12R1/19
• 代理公司: 上海弼興律師事務所 31283
• 代理人: 薛琦;呂學辰

本發明公開了一種表達羧肽酶G2的基因工程菌及其制備方法和應用。所述的基因工程菌為大腸桿菌(Escherichia coli)中同時表達SUMO蛋白標簽和羧肽酶G2基因的基因工程菌，表達所述SUMO蛋白標簽的SMT3基因位于表達所述羧肽酶G2的CPG2基因的上游。利用本發明的基因工程菌進行CPG2的制備，具有表達效率高、表達量大、成本低且易操作等特點，且所表達的重組CPG2蛋白純度高(可高達99.1％)、活性高(可高達1792U/mg)，具有良好的產業化應用前景。

技術領域

本發明屬于生物技術和基因工程技術領域，具體涉及一種表達羧肽酶G2的基因工程菌及其制備方法和應用。

背景技術

羧肽酶G2(carboxypeptidase G2,CPG2)是一種從假單胞菌屬分離獲得的鋅離子依賴型金屬酶，具有水解葉酸及其類似物的C端谷氨酸殘基的作用。目前，CPG2被開發作為在使用高劑量的甲氨蝶呤(MTX)產生毒性后的急救措施。CPG2能夠將MTX快速水解成兩種沒有毒性的代謝物：谷氨酸和2，4-二氨基-N[10]-甲基蝶呤(DAMPA)，并且通過肝臟代謝，從而起到清除血清中MTX的作用。假單胞菌屬菌株RS-16的CPG2基因最初被克隆到大腸桿菌后，其表達水平相對于菌株RS-16降低了100倍。根據Jeyaharan D等人對CPG2結構進行研究后，通過大腸桿菌表達系統最終獲得了250mg/L具有活性的目的蛋白。CPG2共有415個氨基酸，包括C端的25個信號肽序列和390個成熟蛋白氨基酸序列，分子量為84kD。CPG2為二聚體形式，并且每條單體絡合4個Zn²⁺才具有生物活性。由于CPG2沒有二硫鍵和糖基化，所以原核表達系統是其進行大量表達的最佳選擇。

MTX是一種具有抑制二氫葉酸還原酶活性的葉酸類似物，其抑制二氫葉酸還原酶將二氫葉酸還原為四氫葉酸，從而抑制DNA的合成、修復和復制，最終也使蛋白質合成發生障礙。同時，MTX具有高度的細胞周期依賴性，主要在DNA合成(S期)期間起作用。MTX有皮下注射和口服兩種給藥途徑，是目前應用最廣泛的抗癌藥物之一，并且高劑量MTX是治療多種兒童和成人癌癥的重要組成部分。同時，MTX也用于自身免疫性疾病的治療。自1953年首次臨床試驗以來，MTX的使用劑量急劇增加。MTX一個較大的缺點是它對健康細胞的毒性具有劑量和時間的依賴性。MTX主要由腎排泄清除，但是MTX所致的腎功能不全將導致MTX消除延遲。Brigitte等人在2006年發現MTX一旦被多聚在一起，就會在細胞中長期保留。隨著MTX劑量增加，人體中無法快速有效的將MTX全部代謝，從而使MTX在體內的累積，最終導致肝腎損壞、衰竭、中毒性腦病，甚至危及生命等。

目前，對于大劑量使用MTX后中毒的急救措施主要包括充分水化、堿化尿液、血液透析和大劑量使用亞葉酸鈣等方法。亞葉酸鈣和大劑量MTX的聯合使用，在一定程度上能夠使DNA和蛋白質的合成恢復成正常水平，但是當MTX濃度升高，亞葉酸鈣也很難保護骨髓細胞不受到損壞。水化和堿化尿液同樣對于降低MTX血藥濃度的效果較差，時間較長。對于血液透析來說，清除速率與分子量成反比。由于MTX分子量大，水溶性差，組織高分布等特點，使得血液透析很難達到預期的清除效果，無法完全清除血液中的MTX。而對于CPG2來說，給藥后幾分鐘內能夠將血漿中的MTX濃度降低98％以上，從而降低MTX毒性威脅生命的風險。

CPG2還可應用于抗體導向酶前體藥物療法(ADEPT)和基因導向酶前體藥物療法(GDEPT)。ADEPT是一種兩步治療癌癥的方法，其目的是在腫瘤部位選擇性地產生一種強效的細胞毒分子。第一步，腫瘤選擇性抗體與酶通過化學共軛結合；第二步，通過腫瘤選擇性抗體與腫瘤部位結合，釋放前藥后在腫瘤部位將無活性的前藥轉化為活性藥物，起到殺傷腫瘤細胞的作用。因此，該策略對癌細胞具有較強的細胞毒性作用，而對其他細胞的毒性較小。CPG2是ADEPT療法目前應用最廣泛的酶。GDEPT療法與ADEPT療法類似，也是通過兩步法達到治療效果，第一步，將外源性酶的基因轉運至腫瘤細胞；第二步，系統給予無毒性的前體藥物，通過酶代謝為細胞毒藥物。