[發明專利]一種對于犬瘟熱病毒及抗體的ELISA檢測方法

在審

• 申請號: 201910244740.2
• 申請日: 2019-03-28
• 公開（公告）號: CN110108884A
• 公開（公告）日: 2019-08-09
• 發明（設計）人: 郭霄峰;姜賀;翟燕镅
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/569;C07K14/12;C12N15/45;C12N15/70
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 單香杰

1.犬瘟熱病毒N蛋白在制備犬瘟熱檢測試劑盒中的應用，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.犬瘟熱病毒N蛋白的編碼基因在制備犬瘟熱檢測試劑盒中的應用，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一種犬瘟熱病毒N蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1.獲得核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的犬瘟熱病毒N蛋白的編碼基因，并連入表達載體-，得到重組載體；

S2.將重組載體轉化入受體菌，得到重組菌；

S3.挑取陽性的單菌落培養，液體培養基培養至OD₆₀₀＝0.8～1，加入IPTG使其終濃度為0.5～1.5mmol/L，36～38℃繼續培養3.5～7小時，離心取沉淀；

S4.pH＝7.3～7.5 PBS重懸沉淀沉淀，超聲破碎，離心取沉淀；

S5.9～10倍體積預冷的細胞裂解液Ⅱ重懸沉淀，室溫放置3～5分鐘，離心收取沉淀；

S6.15～20倍體積的包涵體溶解緩沖液Ⅰ重懸沉淀，加入咪唑使其終濃度為65～75mmol/L，通過Ni柱；

S7.使用65～75mmol/L咪唑的pH＝7.3～7.5 PBS洗滌3～5次，用300～400mmol/L咪唑洗脫，收集洗脫液即得；

其中，細胞裂解液Ⅱ為pH＝7.9～8.1的40～60mmol/L Tris-Cl、8～12mmol/L EDTA、90～110mmol/L NaCl、0.5～1％(V：V)TritonX-100的水溶液；

包涵體溶解緩沖液Ⅰ為pH＝8.4～8.6 40～60mmol/L Tris-Cl、8～12mmol/L EDTA、90～110mmol/L NaCl、7～8mol/L尿素、0.1～0.3mol/L PMSF的水溶液。

4.一種犬瘟熱ELISA檢測試劑盒，其特征在于，以犬瘟熱病毒N蛋白作為包被抗原。

5.根據權利要4所述的犬瘟熱ELISA檢測試劑盒，其特征在于，還含有包被液、PBS、洗液、封閉液、抗體稀釋液、酶標二抗稀釋液和終止液。

6.根據權利要4所述的犬瘟熱ELISA檢測試劑盒，其特征在于，包被抗原犬瘟熱病毒N蛋白的濃度為不少于4μg/mL。

7.根據權利要6所述的犬瘟熱ELISA檢測試劑盒，其特征在于，包被抗原的方法為犬瘟熱病毒N蛋白的4μg/mL，加入酶標板中，100μL/孔，37℃孵育1小時，放入濕盒中置于4℃過夜；甩干包被液，洗滌液振蕩洗滌3次，1min/每次；加入封閉液，100μL/孔，37℃濕盒封閉3h，甩干包被液，洗滌液振蕩洗滌3次，1min/每次。

8.一種檢測犬瘟熱的酶標版，其特征在于，包被有犬瘟熱病毒N蛋白。

9.權利要求3中所述的重組菌或重組載體任一在制備犬瘟熱檢測試劑盒中的應用。

10.權利要求8所述的酶標版在制備犬瘟熱檢測試劑盒中的應用。