[發明專利]用于檢測C1QTNF3基因219bp缺失可變剪接體的引物、試劑盒及檢測方法在審
| 申請號： | 201910242607.3 | 申請日： | 2019-03-28 |
| 公開（公告）號： | CN109825560A | 公開（公告）日： | 2019-05-31 |
| 發明（設計）人： | 曹果清;張雪蓮;張萬鋒;樂寶玉;張寧芳;成志敏;秦本源;高鵬飛;郭曉紅;蔡春波;李步高 | 申請（專利權）人： | 山西農業大學 |
| 主分類號： | C12Q1/6858 | 分類號： | C12Q1/6858;C12N15/11 |
| 代理公司： | 北京路浩知識產權代理有限公司 11002 | 代理人： | 王文君;黃爽 |
| 地址： | 030801 山西省晉中市太*** | 國省代碼： | 山西;14 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 可變剪接體 基因 檢測 試劑盒 引物 剪接 特異性引物 定量分析 表達水平 引物序列 | ||
1.用于檢測C1QTNF3基因219bp缺失可變剪接體的引物，其特征在于，包括引物CX2-F和CX2-R，它們的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:1-2所示。
2.含有權利要求1所述引物的試劑盒。
3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括用于擴增18S內參基因的引物18S-F和18S-R，它們的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:3-4所示。
4.權利要求1所述引物、或權利要求2或3所述試劑盒在檢測C1QTNF3基因219bp缺失可變剪接體中的應用。
5.一種檢測C1QTNF3基因219bp缺失可變剪接體的方法，其特征在于，包括以下步驟：
1)提取待測樣本總RNA，反轉錄成cDNA；
2)以步驟1)的cDNA為模板，利用引物18S-F和18S-R qPCR擴增18S內參基因，同時利用引物CX2-F和CX2-R qPCR擴增C1QTNF3基因219bp缺失可變剪接體；
3)對步驟2)的qPCR實時監測結果進行擴增曲線和熔解曲線分析，采用2-△△CT相對定量方法計算C1QTNF3基因219bp缺失可變剪接體在不同組織中的表達量，用SPSS version20.0進行差異顯著性檢驗并通過GraphPad Prism5作圖。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟2)中qPCR的反應體系為：2×SYBRPremix Ex Taq II9～11μL，去RNA酶水7～8μL，10μM上游引物0.3～1μL，10μM下游引物0.3～1μL，cDNA模板0.5～2.0μL；
優選地，反應體系為：2×SYBR Premix Ex Taq II10μL，去RNA酶水7.4μL，10μM上游引物0.3μL，10μM下游引物0.3μL，cDNA模板2.0μL。
7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟2)中qPCR的反應程序為：92～96℃預變性30s～6min；92～96℃變性5～12s，55～65℃退火25～35s，35～45個循環；
優選地，反應程序為：95℃預變性30s；95℃變性5s，59℃退火30s，45個循環。
8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟2)中所述2×SYBR Premix Ex Taq II包括含DNA聚合酶的Ex Taq HS、dNTPs、氯化鎂、SYBR Green I和PCR反應緩沖液。
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