[發明專利]調控Bcl-x基因選擇性剪接的反義寡核苷酸及其應用

有效

• 申請號: 201910242054.1
• 申請日: 2019-03-28
• 公開（公告）號: CN109943565B
• 公開（公告）日: 2020-05-05
• 發明（設計）人: 劉靜;張靜;孫帆;王小中;王燕;鄔艷
• 申請（專利權）人: 南昌大學第二附屬醫院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;A61K31/7088;A61K45/06;A61P35/02
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

本發明公開了一種調控Bcl?x基因選擇性剪接的反義寡核苷酸及其應用，所述核苷酸包含如下序列：5′?GCT TGG TTC TTA CCC AGC CGC CGT T?3′（SEQ ID NO.1），所述調控Bcl?x基因選擇性剪接的反義寡核苷酸可以用于制備治療慢性粒細胞白血病或伴Bcl?x剪接異常腫瘤的藥物，尤其用于慢性粒細胞白血病的化療增敏、阻止慢性粒細胞白血病進展或抑制耐藥。

技術領域

本發明屬于生物制藥技術領域，涉及一種反義寡核苷酸，具體涉及一種調控Bcl-x基因選擇性剪接的反義寡核苷酸以及其在制備用于慢性粒細胞白血病化療增敏、阻止慢性粒細胞白血病進展和抑制耐藥的藥物和制備用于治療伴Bcl-x剪接異常腫瘤藥物中的應用。

背景技術

選擇性剪接(alternative splicing)是指一個信使核糖核酸(mRNA)前體中通過不同的剪接方式(選擇不同的剪接位點組合)產生不同的mRNA剪接異構體，使最終的蛋白產物會表現出不同或者相互拮抗的功能和結構特性。Bcl-x是Bcl-2家族成員之一，其通過選擇性剪接主要生成兩種剪接異構體，Bcl-xL和Bcl-xS，Bcl-xL是重要的抗凋亡蛋白，而Bcl-xS則是重要的促凋亡蛋白，兩者生物功能相互拮抗，表達處于平衡狀態，當Bcl-x基因的剪接發生異常時，Bcl-xL/Bcl-xS比值顯著上調，現已證實這是乳腺癌等腫瘤發生、發展的關鍵分子事件，同時也是肺癌等腫瘤出現化療抵抗的重要分子基礎。如今，慢性粒細胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)作為起源于造血干細胞的惡性骨髓增殖性疾病也面臨著化療抵抗及耐藥的問題，靶向BCR-ABL的第一、二代酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinaseinhibitors,TKIs)的化療耐藥已成為其治療的最主要障礙，尤其是加速期和急變期CML對化療藥物的抵抗更加嚴重，患者預后極差，應用TKIs或其它化療藥物治療均無法取得長期療效。本發明申請人前期研究發現，CML中Bcl-x基因發生異常剪接大量轉錄生成Bcl-xL，而Bcl-xS相應減低，致 Bcl-xL/Bcl-xS比值顯著增高，應用第一代TKIs伊馬替尼(imatinib，IM)能糾正CML細胞中該異常剪接事件，并且Bcl-xS表達增加是imatinib誘導CML細胞凋亡的重要機制之一。

早在19世紀70年代，反義核苷酸(AON)的概念就被學者提出，它是指一段與靶基因mRNA互補的一段單鏈DNA或RNA序列，通常由十幾到幾十個堿基組成，通過堿基互補原理，干擾基因的復制、轉錄、mRNA的剪接加工、輸出和翻譯等各個環節，從而調節細胞的生長分化等。迄今，反義核苷酸類藥物成為科學研究的一個熱點，也為抗病毒及抗腫瘤治療提供了新的思路。然而，它也存在著天然的弊端。以第三代反義核苷酸—嗎啉反義寡核苷酸(antisense morpholino oligomer,AMO)為例，其最大的缺陷在于特殊的分子結構導致其不帶有任何電荷，使得AMO無法被細胞表面的任何受體所識別，同時無法通過轉染的方式導入到細胞內。因此只有通過物理損傷細胞膜的方式才能將AMO分子導入細胞，這個缺陷極大限制了AMO的應用。為此，Gene Tools公司開發出了一種特定的傳送載體，稱之為“三嗪八胍結構樹”，該載體的核心為一個三嗪核，三嗪核共有三個N-末端，相對的兩個N-末端分別結合四個胍頭結構，第三個N-末端則和AMO共軛結合。該載體內的八個胍頭結構能通過靜電引力、氫鍵與胞膜結構中的磷脂結合，高效攜帶AMO穿越胞膜結構到達胞漿和胞核。這種載體與AMO共軛結合形成一個具有轉運功能且具有生物學效應的整體，即 Vivo-Morpholino反義寡核苷酸(Vivo-Morpholino Antisense Oligomer，vMO)(參見US patent No.7935816及圖2)：。