[發明專利]一種雙sgRNA位點敲除RSPH6A基因的CRISPR/Cas9系統與應用

在審

• 申請號: 201910242004.3
• 申請日: 2019-03-28
• 公開（公告）號: CN109929845A
• 公開（公告）日: 2019-06-25
• 發明（設計）人: 趙恩峰;賀小宏;王延賓;任江濤;韓露
• 申請（專利權）人: 南京北恒生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/90;C12N9/22;C12N15/66;C12N5/10;C12Q1/686
• 代理公司: 南京眾聯專利代理有限公司 32206
• 代理人: 盧倩

本發明屬于生物工程技術領域，特別涉及腫瘤發生、發展相關基因敲除方法，具體涉及一種雙sgRNA位點敲除RSPH6A基因的CRISPR/Cas9系統與應用，本發明首次雙位點敲除法，采用在同一外顯子上設計兩個sgRNA序列，針對該外顯子上兩個位點進行切割，可高效敲除RSPH6A基因，且只需PCR、電泳即可確定是否敲除成功，大大降低了敲除后鑒定成本，且敲除后只有一種突變型，大大增加了敲除結果的穩定性；將含有所述sgRNA的CRISPR/Cas9系統轉染細胞，可獲得敲除RSPH6A基因的細胞株。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，特別涉及腫瘤發生、發展相關基因敲除方法，具體涉及一種雙sgRNA位點敲除RSPH6A基因的CRISPR/Cas9系統與應用。

背景技術

RSPH6A(radial spoke head 6 homolog A)基因編碼的蛋白質類似于海膽徑向輻條頭蛋白。徑向輻射蛋白復合物形成真核鞭毛軸絲的一部分，位于雙管微管的外環和中心的微管對之間。徑向輻射蛋白能夠調節動力蛋白的活性和鞭毛彎曲模式的對稱性，在腫瘤轉移過程中起重要左右，深入研究RSPH6A有助于發現腫瘤轉移的重要機制，為腫瘤的診斷和治療提供新的思路，同時也是腫瘤新標記物的重要尋找方向。

CRISPR/Cas系統是細菌和古細菌在長期演化過程中形成的一種適應性免疫防御，可用來消除入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas系統通過將入侵噬菌體和質粒DNA的片段整合到CRISPR中，并利用相應的CRISPRRNAs(crRNAs)來指導同源序列的降解，從而提供免疫性。此系統的工作原理是crRNA(CRISPR-derivedRNA)通過堿基配對與tracrRNA(trans-activatingRNA)結合形成tracrRNA/crRNA復合物，此復合物引導核酸酶Cas9蛋白在與crRNA配對的序列靶位點剪切雙鏈RNA。通過人工設計這兩種RNA，可以改造形成具有引導作用的sgRNA(shortguideRNA)，引導Cas9對DNA的進行定點切割，CRISPR/Cas系統具有操作簡單，剪切效率高等特點。

目前，CRISPR/Cas基因敲除技術已廣泛應用于果蠅、大鼠、小鼠、斑馬魚等實驗模型。傳統的敲除方法使用一個sgRNA，針對一個位點進行敲除，雖然效率高，但DNA自主修復不確定性高，且缺失1個堿基不宜于鑒定，往往需要大量測序，花費大量資金進行鑒定。

發明內容

本發明解決現有技術中存在的上述技術問題，提供一種雙sgRNA位點敲除RSPH6A基因的CRISPR/Cas9系統與應用。

為解決上述問題，本發明的技術方案如下：

一種敲除RSPH6A基因的sgRNA，包括RSPH6A sgRNA-1和RSPH6A sgRNA-2；

所述RSPH6A sgRNA-1的序列如下：

RSPH6A sgRNA-1：TCTTTCGGGCGTTCACGATC；(SEQ ID No.1)

RSPH6A sgRNA-1 oligo1：5’-caccgTCTTTCGGGCGTTCACGATC-3’；(SEQ ID No.2)

RSPH6A sgRNA-1 oligo2：5’-aaacGATCGTGAACGCCCGAAAGAc-3’；(SEQ ID No.3)

所述RSPH6A sgRNA-2的序列如下：

RSPH6A sgRNA-2：GGCCCAGATAGCCCGCATCT；(SEQ ID No.4)

RSPH6A sgRNA-2 oligo1：5’-caccgGGCCCAGATAGCCCGCATCT-3’；(SEQ ID No.5)