[發明專利]一種雙sgRNA位點敲除RSPH6A基因的CRISPR/Cas9系統與應用

在審

• 申請號: 201910242004.3
• 申請日: 2019-03-28
• 公開（公告）號: CN109929845A
• 公開（公告）日: 2019-06-25
• 發明（設計）人: 趙恩峰;賀小宏;王延賓;任江濤;韓露
• 申請（專利權）人: 南京北恒生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/90;C12N9/22;C12N15/66;C12N5/10;C12Q1/686
• 代理公司: 南京眾聯專利代理有限公司 32206
• 代理人: 盧倩

1.一種敲除RSPH6A基因的sgRNA，其特征在于，包括RSPH6A sgRNA-1和RSPH6A sgRNA-2；

所述RSPH6A sgRNA-1的序列如下：

RSPH6A sgRNA-1：TCTTTCGGGCGTTCACGATC；

RSPH6A sgRNA-1 oligo1：5’-caccgTCTTTCGGGCGTTCACGATC-3’；

RSPH6A sgRNA-1 oligo2：5’-aaacGATCGTGAACGCCCGAAAGAc-3’；

所述RSPH6A sgRNA-2的序列如下：

RSPH6A sgRNA-2：GGCCCAGATAGCCCGCATCT；

RSPH6A sgRNA-2 oligo1：5’-caccgGGCCCAGATAGCCCGCATCT-3’；

RSPH6A sgRNA-2 oligo2：5’-aaacAGATGCGGGCTATCTGGGCCc-3’。

2.一種雙sgRNA位點靶向敲除RSPH6A基因的CRISPR/Cas9系統，其特征在于，包括權利要求1所述RSPH6A sgRNA-1和RSPH6A sgRNA-2的DNA序列。

3.如權利要求2所述的雙sgRNA位點靶向敲除RSPH6A基因的CRISPR/Cas9系統的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1，使用BsmbI酶切CRISPR/Cas9載體LentiCRISPR V2，得到酶切后的載體；

步驟2，將所述靶向敲除RSPH6A基因的sgRNA的DNA序列磷酸化后與酶切后的LentiCRISPR-V2載體連接，得到得到靶向敲除RSPH6A基因的LentiCRISPR V2-RSPH6AsgRNA-1&LentiCRISPR V2-RSPH6A sgRNA-2，構建靶向敲除RSPH6A基因的CRISPR/Cas9系統。

4.如權利要求2或3所述靶向敲除RSPH6A基因的CRISPR/Cas9系統在制備敲除RSPH6A基因的細胞株中的應用。

5.一種敲除RSPH6A基因的細胞株，其特征在于，所述細胞株是運用權利要求2所述雙sgRNA位點靶向敲除RSPH6A基因的CRISPR/Cas9系統進行靶向敲除得到的細胞中的RSPH6A基因缺失的細胞株。

6.如權利要求5所述敲除RSPH6A基因的細胞株，其特征在于，所述細胞株為A549細胞株。

7.如權利要求5所述敲除RSPH6A基因的細胞株，其特征在于，所述RSPH6A基因的具體靶向敲除位點為：

AGGATGTGCTGTGTGTGATGCACCCAGTTGGCCATGGAGTCGACCAGCTCCAGCACGGGGATGCCCTCGAAGTCCGGGTTCTCCTCGTAGGAGTCGCGCCCAGCACCACCTTCCTCCTCCTCGTCGCCCTCCTCCTCACTAAACTGGTAGAAGCCCAGCGGGCTGACCTGCGTGGCGGCCAGAT-------------------------------------------------------TCTCGGGCTGGAGTGACGTGGGGCAGCCGCGTCCATGGCAGGCCCGGCTCGTTGCACACAAAGTACAGGTACTTGTTGGCGCCTGAGCGGCTCTCCTCCTTGGGGATCACGGGCGGCGGCTTCCATACGGACTTAGGGACGATGTCCACGGCCTTCTCCTCGTCCTCCTCGCCCTCCTCCTCGCCGTGCGCCTCCATGACCTCGCCACCTTCCGTCATCTCCTCCACCTCCTCCTCCTCTGCCTCCTCCTCGCCCTCCCGGAATTCCACCTCGGCCACCAGGTAGCTGCGTTTGATTCCCAGGAT。