[發(fā)明專利]一種特立帕肽的合成方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910240603.1
• 申請日: 2019-03-27
• 公開（公告）號: CN109879954B
• 公開（公告）日: 2023-03-31
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 冷國慶;張琪;蘇宏健;王麗莉;田輝;楊文龍;余榮熹;景文巖;王艷;張鳳蓮;侯繼元;謝俊;楊樺;于通浩;冷青
• 申請（專利權(quán)）人: 哈爾濱吉象隆生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C07K14/635
• 分類號: C07K14/635;C07K1/14;C07K1/08;C07K1/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種特立帕肽的合成方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)Fmoc-Phe-樹脂的合成：

稱取替代度為0.3mmol/g的Wang樹脂1mol，加入固相反應(yīng)柱中，用DMF溶脹樹脂50分鐘后，取5mol Fmoc-Phe-OH和4mol HOBt加入固相反應(yīng)柱中，20-25℃反應(yīng)2小時；反應(yīng)結(jié)束后用DMF洗滌3次，然后加入3mol DIC和DMAP的混合液，20-25℃攪拌反應(yīng)6小時；用DMF洗滌4次，DCM洗滌2次后，甲醇收縮抽干，得到Fmoc-Phe-WangResin，檢測替代度為0.12mmol/g；

(2)肽樹脂A的合成：

稱取替代度為0.12mmol/g的Fmoc-Phe-WangResin 1mol，加入固相反應(yīng)柱中，用DMF溶脹樹脂30分鐘后，加入DBLK在20℃下反應(yīng)20分鐘脫除Fmoc保護(hù)，然后用DMF洗滌4次，DCM洗2次；取8mol Fmoc-Asn(Trt)-OH和3mol HOBt溶于體積比為1∶1的DCM和DMF混合溶液，冰浴20分鐘，加入3mol DIC活化10分鐘后加入到固相反應(yīng)柱中，30℃反應(yīng)3小時，然后用DMF洗滌3次；

重復(fù)上述脫除Fmoc保護(hù)和加入相應(yīng)氨基酸偶聯(lián)的步驟，按照片段的順序，依次完成Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH和Boc-Ser-OH的偶聯(lián)；加入DBLK在20℃下反應(yīng)20分鐘脫除Fmoc保護(hù)，然后用DMF洗滌3次，得到肽樹脂A；

(3)肽樹脂B的合成：

取1mol肽樹脂A加入固相反應(yīng)柱中，取10mol Fmoc-Asn(Trt)-OH和3mol HOBt溶于體積比為1∶1的DCM和DMF混合溶液，冰浴10分鐘后滴入3mol DIC，活化5分鐘，加入固相反應(yīng)柱中，30℃反應(yīng)3小時；反應(yīng)結(jié)束后加入DBLK在20℃下反應(yīng)20分鐘脫除Fmoc保護(hù)，然后用DMF洗滌4次，DCM洗2次，得到肽樹脂B；

(4)特立帕肽粗肽的合成：

取1mol肽樹脂B加入固相反應(yīng)柱中，將8mol Fmoc-Leu-OH和3mol HOBt溶于體積比為1∶1的DCM和DMF混合溶液，冰浴10分鐘后滴入3mol DIC，活化5分鐘，加入固相反應(yīng)柱中，30℃反應(yīng)3小時；反應(yīng)結(jié)束后加入DBLK在20℃下反應(yīng)20分鐘脫除Fmoc保護(hù)，然后用DMF洗滌4次，DCM洗2次；重復(fù)上述脫除Fmoc保護(hù)和加入相應(yīng)氨基酸偶聯(lián)的步驟，按照片段的順序，依次完成Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH和Fmoc-Ser(tBu)-OH的偶聯(lián)，脫除Fmoc保護(hù)基團(tuán)后，用甲醇收縮，樹脂真空干燥過夜，得到特立帕肽樹脂；

將特立帕肽樹脂置于裂解反應(yīng)器中，以15ml/g樹脂的量加入裂解試劑，25℃攪拌4小時；反應(yīng)物用砂芯漏斗過濾，收集濾液，樹脂再用少量TFA洗滌4次，合并濾液后減壓濃縮；加入冰凍的無水乙醚沉淀，用無水乙醚洗滌4次，真空干燥得到白色粉末固體，即特立帕肽粗肽，純度為89.2％；

其中，所述裂解試劑為由體積百分比為75％的TFA、體積百分比為15％的EDT、體積百分比為10％的水組成的混合試劑；

(5)特立帕肽純品的制備：

將獲得的特立帕肽粗肽干燥稱重后用水溶解，經(jīng)C8柱純化，流動相為1％的TFA水溶液，流速為300mL/min，檢測波長為214nm，用HPLC跟蹤收集所需要的流出液，冷凍干燥，得特立帕肽純品。