[發(fā)明專利]一種基于高通量測序的IGH基因重排檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910239234.4
• 申請日: 2019-03-27
• 公開（公告）號: CN109929924B
• 公開（公告）日: 2022-11-08
• 發(fā)明（設計）人: 曹金良;齊善康;崔展飛;康曉婷
• 申請（專利權）人: 上?？漆t(yī)聯(lián)創(chuàng)醫(yī)學檢驗所有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 上海申新律師事務所 31272
• 代理人: 俞滌炯

本發(fā)明涉及一種基于高通量測序的IGH基因重排檢測方法，其包括：根據(jù)已知的IGH基因序列設計及合成擴增引物，對擴增片段進行多重擴增反應，獲得IGH擴增引物；對IGH擴增產物進行純化，并進行末端修飾；將修飾后的擴增產物與高通量測序平臺的接頭進行連接并進行連接修復、純化，得到高通量測序文庫；上機測序及數(shù)據(jù)分析；其中，所述擴增引物包括設計位置分別位于FR1、FR2和FR3區(qū)域的正向引物和設計位置位于J區(qū)的反向引物。本發(fā)明還涉及用于IGH基因重排的高通量測序檢測的試劑盒和系統(tǒng)。本發(fā)明采用高通量測序的手段檢測IGH基因重排，可以極大的提高檢測靈敏度及準確性，并且可以準確地得到單克隆序列信息，具有廣泛的應用前景。

技術領域

本發(fā)明涉及基因測序技術領域，尤其涉及一種基于高通量測序的IGH基因重排檢測方法。

背景技術

IGH基因主要由可變區(qū)(variabl V)、多變區(qū)(diversity D)、連接區(qū)(joining J)組成，每個基因區(qū)域均由多個基因片段組成，其中可變區(qū)(V)和連接區(qū)(J)中存在的相對保守的結構區(qū)(frame work region，F(xiàn)R)，其在V區(qū)有3個，分別稱作FR1、FR2、FR3，J區(qū)也有1個。隨著淋巴細胞從母細胞分化到成熟淋巴細胞，原始的IGH基因在重組酶的作用下，剪切各個基因區(qū)域中的某一片段，并重新連接，形成新的具有表達功能的基因，即發(fā)生基因重排。來源于不同基因片段重排后的基因，保證了表達蛋白的多樣，如正常的B淋巴細胞呈現(xiàn)IGH基因重排的多克隆性。

目前IGH重排的檢測主要的分子生物學手段為一代測序平臺的毛細管電泳+片段分析，即利用帶有熒光標記的引物序列，特異性的擴增IGH基因區(qū)域，通過跑毛細管電泳的方法，形成顯示不同片段大小分布的峰圖，從而得到IGH基因在體內的單克隆情況。但該分析方法存在以下缺點：

1.檢測靈敏度低，由于技術平臺的限制，單克隆檢測靈敏度較低；

2.存在假陽性狀況，由于判讀標準是序列讀長，會導致部分序列不同，長度相同的擴增片段混淆；

3.應用范圍窄，目前主要應用于淋巴系統(tǒng)疾病腫瘤性或增生性的判斷。

發(fā)明內容

為了克服現(xiàn)有技術的缺陷，本發(fā)明采用高通量測序的手段檢測IGH基因重排，相比于目前的方法，可以極大的提高檢測靈敏度及準確性，并且可以準確地得到單克隆序列信息，具有廣泛的應用前景，例如得到的受體識別區(qū)序列可以應用在細胞免疫研究領域；由于極高的靈敏度可以用于一些腫瘤性疾病的微小殘留病灶監(jiān)測等等。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：

本發(fā)明的第一個目的是提供一種基于高通量測序的IGH基因重排檢測方法，其包括如下步驟：

步驟1)根據(jù)已知的IGH基因序列，設計及合成擴增引物；

步驟2)采用擴增引物對擴增片段進行多重擴增反應，獲得IGH擴增引物；

步驟3)對IGH擴增產物進行純化，并對純化后的產物進行末端修飾；

步驟4)將修飾后的擴增產物與高通量測序平臺的接頭進行連接并進行連接修復，對連接修復產物進行純化，得到高通量測序文庫；

步驟5)將高通量測序文庫上機測序及數(shù)據(jù)分析；

其中，所述擴增引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的設計位置分別位于FR1、FR2和FR3區(qū)域，所述反向引物的設計位置位于保守區(qū)J區(qū)。

為了進一步優(yōu)化上述IGH基因重排檢測方法，本發(fā)明還包括如下技術措施：

進一步地，F(xiàn)R1區(qū)的正向引物為23條，擴增目的片段長度為370bp；FR2區(qū)的正向引物為34條，擴增目的片段長度為260bp；FR3區(qū)的正向引物為33條，擴增目的片段長度為370bp；J區(qū)的反向引物共4條。