[發明專利]一種基于高通量測序的IGH基因重排檢測方法

有效

• 申請號: 201910239234.4
• 申請日: 2019-03-27
• 公開（公告）號: CN109929924B
• 公開（公告）日: 2022-11-08
• 發明（設計）人: 曹金良;齊善康;崔展飛;康曉婷
• 申請（專利權）人: 上海科醫聯創醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 上海申新律師事務所 31272
• 代理人: 俞滌炯

1.一種非診斷目的的基于高通量測序的IGH基因重排檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟1）根據已知的IGH基因序列，設計及合成擴增引物；

步驟2）采用擴增引物對擴增片段進行多重擴增反應，獲得IGH擴增引物；

步驟3）對IGH擴增產物進行純化，并對純化后的產物進行末端修飾；

步驟4）將修飾后的擴增產物與高通量測序平臺的接頭進行連接并進行連接修復，對連接修復產物進行純化，得到高通量測序文庫；

步驟5）將高通量測序文庫上機測序及數據分析；

其中，所述擴增引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的設計位置分別位于FR1、FR2和FR3區域，所述反向引物的設計位置位于保守區J區；

所述FR1區的正向引物的序列如SEQ ID No. 1~23所示，FR2區的正向引物的序列如SEQID No.24~57所示；FR3區的正向引物的序列如SEQ ID No. 58~90所示；J區的反向引物如SEQ ID No.91~94所示。

2.根據權利要求1所述的IGH基因重排檢測方法，其特征在于，在所述步驟2）中，根據擴增片段進行分組多重擴增，擴增完成后將各組擴增產物進行混合，以得到完全的IGH擴增產物，所述多重擴增采用Taq DNA聚合酶。

3.根據權利要求1所述的IGH基因重排檢測方法，其特征在于，在所述步驟3）中，IGH擴增產物進行磁珠法純化，采用T4多核苷酸激酶對純化后的產物進行末端加A修飾。

4.根據權利要求1所述的IGH基因重排檢測方法，其特征在于，在所述步驟4）中，將修飾后的擴增產物與用T4 DNA連接酶與高通量測序平臺的接頭P1和Barcode進行連接，并加入DNA聚合酶進行連接修復，對連接修復產物進行純化，得到所述高通量測序文庫；該步驟還包括使用文庫定量試劑對建好的文庫進行定量。

5.根據權利要求1所述的IGH基因重排檢測方法，其特征在于，在步驟5）中，數據分析得到的結果包括：用生物信息學方法可得到大量序列信息，存在單克隆的序列可得到具體的克隆比例，通過免疫數據庫比對，還可得到IGH基因序列的結構信息。

6.根據權利要求1所述的IGH基因重排檢測方法，其特征在于，檢測出的IGH基因重排序列包括SEQ ID No. 95。

7.一種基于權利要求1-6任一項所述IGH基因重排檢測方法的用于IGH基因重排的高通量測序檢測的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：FR1區的正向引物、FR2區的正向引物、FR3區的正向引物、J區的反向引物、多重PCR擴增試劑、磷酸化試劑、測序接頭連接試劑。

8.根據權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述FR1區的正向引物的序列如SEQ IDNo. 1~23所示，FR2區的正向引物的序列如SEQ ID No.24~57所示；FR3區的正向引物的序列如SEQ ID No. 58~90所示；J區的反向引物如SEQ ID No.91~94所示。

9.根據權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述多重PCR擴增試劑包括Taq DNA聚合酶和擴增緩沖液；磷酸化試劑包括T4多核苷酸激酶、dNTP和反應緩沖液；測序接頭連接試劑包括T4 DNA連接酶、DNA聚合酶、接頭P1、接頭Barcode 及緩沖液。

10.一種用于IGH基因重排的高通量測序檢測的系統，其特征在于，所述系統包括如權利要求7~9中任一項所述的用于IGH基因重排的高通量測序檢測的試劑盒和高通量測序平臺。