[發(fā)明專利]一種粗糙脈胞菌外切葡聚糖酶突變菌株的構(gòu)建方法和應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910238620.1
• 申請日: 2019-03-27
• 公開（公告）號: CN109837232A
• 公開（公告）日: 2019-06-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 韓曉云;王曦冉;孫慶申;鄭桂華;李珊珊
• 申請（專利權(quán)）人: 黑龍江大學(xué)
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/56;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標(biāo)事務(wù)所 23109
• 代理人: 岳泉清

一種粗糙脈胞菌外切葡聚糖酶突變菌株的構(gòu)建方法和應(yīng)用，它涉及菌株構(gòu)建以及發(fā)酵領(lǐng)域，本發(fā)明的目的是為了構(gòu)建粗糙脈胞菌外切葡聚糖酶突變菌株，以提高其降解纖維素的能力，并通過與牛糞混合共發(fā)酵玉米芯，實(shí)現(xiàn)玉米芯降解效果，本發(fā)明首先設(shè)計(jì)粗糙脈胞菌引物，對NCU07340基因進(jìn)行克隆，并與qa?5myc.6His載體進(jìn)行連接，成功構(gòu)建載體質(zhì)粒，將載體轉(zhuǎn)入組氨酸缺陷型菌株4200his^－中，Western雜交檢驗(yàn)得到cbh?1其表達(dá)蛋白大小約為90KDa。發(fā)現(xiàn)cbh?1基因過表達(dá)菌株菌絲生長狀態(tài)要強(qiáng)于野生菌株。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明將cbh?1基因過表達(dá)菌株與牛糞共同發(fā)酵玉米芯。本發(fā)明應(yīng)用于玉米芯發(fā)酵領(lǐng)域。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及菌株構(gòu)建以及發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種粗糙脈胞菌外切葡聚糖酶突變菌株的構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

玉米芯的主要成分是纖維素，纖維素在植物細(xì)胞壁中與半纖維素、木質(zhì)素高度的鑲嵌交纏在一起，在其外部包裹著許多果膠類物質(zhì)，同時(shí)由于纖維素本身為絲狀結(jié)晶結(jié)構(gòu)，使秸稈徹底降解利用成為一大難題,固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵是微生物發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶降解秸稈的兩種發(fā)酵方式。采用其中固態(tài)發(fā)酵法是一種比較經(jīng)濟(jì)、簡便而有效的處理方法。固態(tài)發(fā)酵在對處理農(nóng)作物固體廢物的應(yīng)用方便歷史悠久，固態(tài)發(fā)酵為巴西菇培養(yǎng)料的發(fā)酵方式，20世紀(jì)70年代法國、荷蘭和美國等發(fā)達(dá)國家開始采用二次發(fā)酵技術(shù)，并且實(shí)現(xiàn)了蘑菇的現(xiàn)代工廠化形式。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了構(gòu)建粗糙脈胞菌外切葡聚糖酶(CBH)突變菌株，以提高其降解纖維素的能力，并通過與牛糞混合共發(fā)酵玉米芯，實(shí)現(xiàn)玉米芯降解效果。

本發(fā)明的一種粗糙脈胞菌外切葡聚糖酶突變菌株的構(gòu)建方法，它是按照以下步驟進(jìn)行的：

一、cbh-1基因獲得

設(shè)計(jì)引物對，以粗糙脈孢菌的基因序列為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，并膠回收目的基因片段；

引物1 5'-ttcatCGATGAATTCATGCTCGCCAAGTTCGCTGC-3'；

引物2 5'-GGCAAGCTGATCCCCCTCATACGGTGGATGTATTGCC-3'；

二、無縫克隆構(gòu)建載體

對載體進(jìn)行酶切，得到線性化載體；將步驟一獲得的目的基因片段與線性化載體連接，獲得無縫克隆構(gòu)建載體；

三、將步驟二得到的無縫克隆構(gòu)建載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，驗(yàn)證目的基因成功轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)后，即完成所述的粗糙脈胞菌外切葡聚糖酶突變菌株的構(gòu)建。

該菌株與牛糞混合后共同發(fā)酵玉米芯。

本發(fā)明包含以下有益效果；

本發(fā)明首先利用Neurospora crassa Database設(shè)計(jì)粗糙脈胞菌引物，對NCU07340基因進(jìn)行克隆，并與qa-5myc.6His載體進(jìn)行連接，成功構(gòu)建載體qa-5myc.6His-NCU07340質(zhì)粒，通過電轉(zhuǎn)化方法將載體轉(zhuǎn)入組氨酸缺陷型菌株4200his^－中，Western雜交檢驗(yàn)得到cbh-1其表達(dá)蛋白大小約為90KDa。進(jìn)一步對基因過表達(dá)菌株的生長表型進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)cbh-1基因過表達(dá)菌株(qa-5myc.6His-NCU07340)菌絲生長狀態(tài)要強(qiáng)于野生菌株。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明將cbh-1基因過表達(dá)菌株(qa-5myc.6His-NCU07340)與牛糞共同發(fā)酵玉米芯。